宋志华 毕小宝
【摘要】目的 探讨姜黄素对脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）刺激腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophages，PMs）分泌炎症因子的影响。方法分离、培养腹腔巨噬细胞，用不同浓度姜黄素（12.5、25、50 mg/L）预处理细胞12 h，进而使用100 ng/ml LPS刺激细胞，12 h后收集培养基上清液，ELISA检测促炎介质肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白介素6（interleukin-6， IL-6）的含量；30 min后收集细胞裂解物，Western blot检测p38 MAPK激酶活性。结果未经处理的腹腔巨噬细胞经LPS刺激12 h后，上清中TNF-α、IL-6的表达水平显著上升（p<0.05）；12.5 mg/L姜黄素对LPS诱导的TNF-α、IL-6表达无显著影响（p>0.05）；而50、25 mg/L姜黄素可以明显抑制LPS诱导的TNF-α、IL-6的表达（p<0.05）；且25 mg/L姜黄素能够明显抑制LPS激活的p38 MAPK激酶的磷酸化水平。结论一定浓度的姜黄素可以抑制LPS刺激腹腔巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-6的分泌，进而减轻炎症反应的程度。
【关键词】姜黄素腹腔 巨噬细胞 脂多糖 炎症 因子
【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of curcumin on inflammatory cytokine release by peritoneal macrophages （PMs） stimulated by lipopolysaccharide （LPS）.MethodPMs were isolated and cultured， then pretreated with different concentrations of curcumin （12.5、25、50 mg/L） for 12 h followed by 100 ng/ml LPS stimulation. TNF-α and IL-6 in the cell supernatants were detected by ELISA after 12 h LPS stimulation； the activity of p38 MAPK in the cell lysates was investigated by Western blot after 30 min LPS stimulation. ResultTNF-α and IL-6 levels increased dramatically after 12 h stimulation in the control group （p<0.05）； and 12.5 mg/L curcumin had no effect on TNF-α and IL-6 expression （p>0.05）. However， both expression can be inhibited by 50 and 25 mg/L curcumin （p<0.05）. Furthermore， the phosphorylation of p38 MAPK can be inhibited by 25 mg/L curcumin.ConclusionCertain concentrations of curcumin can inhibitor the release of TNF-α and IL-6 by PMs stimulated by LPS， which can further alleviate inflammation.
【Key words】 Curcumin， Peritoneal macrophages， Lipopolysaccharide， Inflammatory cytokines
【Author′s address】Pharmacy Department of Nanfang Hospital，Southern Medical University
Department of Anesthesiology， Guangzhou Women and Children Medical Center
doi：10.3969/j.issn.1671-332X.2014.10.003
姜黄素（curcumin）是从植物姜黄、郁金、莪术等的根茎中提取、分离出的一种低相对分子质量的多酚物质。近年研究显示，姜黄素具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等。本实验主要探讨姜黄素对脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）刺激腹腔巨噬细胞分泌炎症因子的影响，为研究姜黄素的抗炎机制提供相关理论依据。
1材料和方法
1.1实验动物
8周雄性BALB/c小鼠以无特定病原体动物（specific pathogen free， SPF）级饲养条件饲养，由南方医科大学动物中心提供，动物合格证号为：44002100002747
1.2主要仪器和试剂
细胞培养箱、酶标仪、DMEM、胎牛血清、mouse TNF-α ELISA kit、mouse IL-6 ELISA kti、phospho-p38 MAPK antibody。
1.3统计学分析
1.3.1小鼠腹腔巨噬细胞的分离、培养8周BALB/c小鼠乌拉坦（0.6 ml/100 g）腹腔注射麻醉后，置于解剖板上，用针头固定四肢，腹腔注射无菌的磷酸盐缓冲液（PBS）5 ml，轻柔小鼠腹部2~3 min，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，1000 rpm/min离心5 min，弃上清。重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，接种于24孔板中，2 h后更换培养液，置于37℃、5%CO2培养箱培养过夜，次日用于实验研究。同时台盘蓝染色鉴定细胞存活状况。
1.3.2ELISA检测TNF-α和IL-6分为六组：①对照组；②单独LPS刺激组；③12.5 mg/L姜黄素+ LPS刺激组；④25 mg/L姜黄素+LPS刺激组；⑤50 mg/L姜黄素+ LPS刺激组；⑥单独50 mg/L姜黄素刺激组。实验组细胞预先使用不同浓度姜黄素处理12 h，进而100 ng/ml LPS刺激，12 h后收集细胞上清，ELISA试剂盒检测TNF-α和IL-6的水平。
1.3.3Western blot检测p38 MAPK激酶活性分为四组：①对照组；②单独LPS刺激组；③25 mg/L姜黄素+ LPS刺激组；④单独25 mg/L姜黄素刺激组。实验组细胞预先使用姜黄素处理12 h，进而100 ng/ml LPS刺激，30 min 后收集细胞裂解物，Western blot检测p38 MAPK磷酸化水平。
1.3.4统计学处理
采用spss 13.0软件，计量资料采用±s表示。方差齐时，各组间进行单因素方差分析，p<0.05时具有统计学差异。
2结果
2.1不同浓度姜黄素对LPS诱导腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6水平的调节未经处理的腹腔巨噬细胞经LPS诱导12 h后，细胞培养上清中TNF-α、IL-6蛋白表达水平明显上升，与阴性对照组相比，差异有统计学意义（p<0.05）。50 mg/L、25 mg/L姜黄素能显著降低LPS诱导的TNF-α、IL-6蛋白表达，与LPS刺激组相比，差异有统计学意义（p<0.05），12.5 mg/L姜黄素对二者蛋白表达无显著影响（p>0.05）。50 mg/L、25 mg/L姜黄素对二者蛋白表达抑制率接近50%。
2.2姜黄素对LPS诱导巨噬细胞p38 MAPK活化的影响
LPS能够活化巨噬细胞p38 MAPK激酶，使用p38特异性磷酸化抗体检测到p38激酶的明显磷酸化，差异有统计学意义（p<0.05）；具有抑制TNF-α、IL-6表达的相应浓度的姜黄素（25 mg/L）预处理细胞，检测到p38激酶磷酸化被抑制，差异有统计学意义（p<0.05）。
3讨论
促炎性细胞因子TNF-α、IL-6在LPS启动的炎症反应中发挥着重要的作用，主要由单核细胞和巨噬细胞产生［1］。LPS作用于细胞膜表面模式识别受体TLR4（Toll-like receptor 4， TLR4），通过细胞内信号级联反应活化相应的基因表达，进而引起最终的细胞反应［2］。目前对LPS介导的细胞内信号通路已经有深入的研究，LPS刺激巨噬细胞导致细胞内多个蛋白质磷酸化，p38 MAPK激酶的磷酸化已经证实在其中发挥重要的作用。p38 MAPK参与了LPS激活细胞生成TNF-α、IL-6等促炎性细胞因子的细胞内信号转导过程，对二者的表达具有重要的调节作用，有报道表明p38 MAPK特异性抑制剂SB203580能够显著抑制LPS诱导的TNF-α、IL-6的表达［3］。
巨噬细胞是参与机体天然免疫应答的重要细胞类型。腹腔巨噬细胞是腹腔中常驻吞噬细胞，是机体天然免疫系统的第一道防线，在机体炎症反应中发挥重要作用［4］。本实验采用小鼠原代巨噬细胞，对LPS的反应性更灵敏；更接近与体内真实情况，因此在相关研究中广泛使用。
姜黄素［（3-甲氧基-4-羟基） 苯基-1，6-庚二烯-3，5-二酮］是从姜黄根茎中分离出来的β-二酮类的主要成分，近年来姜黄素抗炎机制的研究逐渐成为热点。已有的研究表明姜黄素可以减轻小鼠肠粘膜炎症损伤，可能的机制是通过抑制p38 MAPK信号通路，进一步减少促炎细胞因子的释放［5］。同时姜黄素能够有效地抑制LPS诱导的血管平滑肌细胞炎症因子的分泌、TLR4的过表达及下游MAPKs信号通路的磷酸化［6］。本实验通过研究不同浓度姜黄素对LPS诱导腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-6水平的调节及姜黄素对LPS诱导巨噬细胞p38 MAPK活化的影响发现，一定浓度的姜黄素可以抑制LPS刺激腹腔巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-6的分泌，进而减轻炎症反应的程度，且可能与其抑制p38激酶的活化有关，初步揭示了姜黄素作用于巨噬细胞的抗炎机制，为进一步研究姜黄素的抗炎机制提供理论依据。
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