杨玉前
南阳市第六人民医院结核病二区，河南南阳 473000
[摘要] 目的 比较T细胞检测和荧光PCR检测两种方法对结核分枝杆菌检测的敏感性、特异性，及在基层结核病防治工作中的应用前景。方法 应用结核分枝杆菌荧光PCR检测2013年10月1日—2014年10月1日采集的194份疑似或确诊活动性肺结核空腹痰标本，并与血液T细胞检测结果进行比较。结果 荧光PCR法与T细胞检测对结核分枝杆菌检测的阳性率为12.9％和7.7%，确诊率分别为56%和93.3%。结论 结核分枝杆菌T细胞检测相比荧光PCR检测的特异性较高，而敏感性相对较差，在临床实践中由于各种干扰因素的存在，两者结合应用可提高结核病的早期诊断率。
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关键词 结核分枝杆菌；荧光PCR；T细胞检测
[中图分类号] R37 [文献标识码] A [文章编号] 1674-074２（２０１5）01（c）－０005-02
The Comparison Between T Cell Assay and Fluorescent PCR Assay for the Detection of Mycobacterium Tuberculosis
YANG Yuqian
Second Inpatient Area of Tuberculosis, Sixth People´s Hospital of Nanyang City, Nanyang, Henan Province, 473000, China
[Abstract] Objective To compare the sensitivity and specificity between T cell assay and fluorescent PCR assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis, and the application prospect in grassroot work of tuberculosis control and prevention. Methods Fluorescent PCR assay was used to detect the Mycobacterium tuberculosis in 194 fasting sputum specimens of suspected or confirmed active tuberculosis collected from October the first 2013 to October the first 2014, and the results were compared with those of blood T cell assay. Results The positive rate of fluorescent PCR assay and T cell assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis was 12.9% and 7.7%, respectively, the diagnosis rate was 56% and 93.3%, respectively. Conclusion The specificity of T cell assay is higher while the sensitivity is poorer compared to the fluorescent PCR assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis. As there are various interfering factors existing in the clinical practice, combinative application of the two methods can improve the early diagnosis rate of tuberculosis.
[Key words] Mycobacterium tuberculosis; Fluorescent PCR; T cell assay
[作者简介] 杨玉前（1978.5-），女，河南南阳人，本科，执业医师，研究方向：结核病的早期诊治。
由于结核病是呼吸道传染病且耐药现象日趋严重，目前结核的流行有不断上升的趋势，据资料显示，全世界约有30％的人受到结核的感染，10％的人最终发展为结核病患者，全世界每年新发结核病例1 000万，死亡病例300万。一些恶性疾病常易合并各种细菌、真菌及结核等感染[1],因此，结核病防治引起全世界的广泛关注，早期发现可疑的结核病患者并实施有效监控、治疗是卫生工作者的重要任务[2]。传统的结核实验室诊断技术如痰涂片、培养、鉴定等存在敏感性低或耗时过长等缺点，在实际应用中有一定的局限[3],不利于早期快速诊断。近年来，分子生物学方法开始应用于结核的临床诊断和疗效判定[4-5]。该研究应用结核分枝杆菌荧光定性PCR和T细胞检测两种方法对2013年10月1日—2014年10月1日采集的194名疑似结核病患者痰液和血液标本进行结核分枝杆菌进行快速检测，并做出初步的分析评价，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
采集南阳市第六人民医院194名疑似结核病患者，其中男104例，女90例，平均年龄（31.9±5.1）岁。
1．2 试剂和仪器
结核杆菌T细胞检测试剂盒购自北京表源生物技术有限公司，结核杆菌荧光PCR试剂盒采购自广州健仑生物科技有限公司，仪器主要有高速台式离心机，PCR扩增仪，美国Turner Designs公司TD-360型荧光仪。
1.3 方法
1.3.1 结核分枝杆菌荧光PCR检测操作步骤 （1）痰液样本处理：①取病人晨痰，加入2倍体积的4% NaOH，反复振摇，置室温20 min，使之充分液化。②取0.5 mL液化痰液加至0.5 mL离心管内，于高速台式离心机1.4万转/分离心10 min，弃上清液。③加灭菌蒸馏水0.5 mL于沉淀中，振荡混匀，1.4万转/分离心10 min，弃上清液。④ 重复步骤③。⑤加样品提取液50 μL于沉淀中，振荡混匀后，置100 ℃水浴中15 min，取出后，样品管1.5万转/分离心5 min，上清液即可作为反应模板。⑥强阳性对照、弱阳性对照和阴性对照不需用NaOH液化，直接从步骤②开始处理。（2）核酸扩增反应：将反应混合液放置于室温后，取出20 μL加入含酶反应管中，再加4 μL己处理的样品上清（调零管中直接加入20 μL反应混合液和4 μL样品提取液），混匀后，1万转/分离心20 s，上PCR扩增仪循环。（3）荧光检测：①仪器校准：反应管在低于40 ℃的室温下平衡5 min后进行测量。TD-360型荧光仪调零，校正。②样品测定：将从PCR扩增仪中取出的反应管逐一放入荧光仪中读数。记录数据。（4）结果判断：样品荧光强度≥100 为阳性，样品荧光强度<100 为阴性。
结果判定：（1）强阳性对照的荧光读值应＞300。（2）弱阳性对照的荧光读值应在100~150之间。（3）阴性对照的荧光读值应＜65。
1.3.2 结核分枝杆菌T细胞检测 （1）T细胞的分离：用肝素锂抗凝采血管采集待检者外周血6 mL，将血液与预热至室温的 RPMI1640 不完全培养液按照体积比 1:1 的比例混匀。按照混匀血样与ficoll淋巴细胞分离液的体积比为2:1 的比例，小心的将血样加在离心管中ficoll淋巴细胞分离液上层，离心细胞，将18 ℃× 1000 g离心20 min。收集细胞层。洗涤收集的细胞，18 ℃× 600 g离心 7 min。重复洗涤1次。将洗涤好的细胞重置于 2 mL AIM-V 培养液中，计数，调整细胞浓度为 2.5×106个/mL。（2）检测：严格按照T细胞检测试剂盒进行检测。
结果判定：(1) 当阴性对照孔斑点数若为 0～5 时，若 TB 刺激物孔比阴性孔紫色斑点数≥5 个，则判为阳性。反之，判为阴性。(2) 当阴性孔紫色斑点数为≥6 时，若 TB 刺激物孔≥阴性孔紫色斑点数的 2 倍，则判为阳性。反之，判为阴性。
1.4 统计方法
该研究所有数据均采用spss 17.0软件进行分析，计数资料采用χ2检验。
2 结果
2.1 荧光PCR检测
194份痰标本进行结核分枝杆菌荧光定量PCR检测，其中25份呈阳性，阳性率为12.9％。
2.2 T细胞检测
同时对这194例疑似患者的血液进行结核分枝杆菌T细胞检测，结果共检出阳性15例，阳性率为7.7％，两种方法的结果比较，见表1。
2.3 荧光PCR与T细胞检测比较
经χ2检验，荧光PCR与T细胞检测两种方法的灵敏度差异有统计学意义（χ2=9.36，P<0.01），特异性差异有统计学意义（χ2=10.7，P<0.01）。
3 讨论
近年来随着国家对控制结核病力度的加大以及各级结核病防止机构的努力，结核病得到了有效的控制，但不容否认的现实是结核病的发生较前15年的态势有明显的加重，结核病对人类的伤害和致残影响巨大，必须尽早发现并控制其发展演进，但诊断结核病的金标准培养法由于结核分枝杆菌培养周期较长，约需20 h左右才繁殖一代，3～4周以上才出现肉眼可见菌落[6]，影响了结核病的早期诊断和治疗，且仍有约20%的结核病人由于各种因素导致无法通过培养确诊。
近年来随着荧光PCR检测技术的临床应用，对痰标本进行结核分枝杆菌特异性扩增、荧光检测，可在1个工作日内确诊结核分枝杆菌感染与否，具有良好的应用前景，灵敏度及特异性较高。文献报道荧光PCR检测结核分枝杆菌的敏感性、特异性较高[7-8]，可达到97％～99.6％[9]。但这项技术由于在标本的收集以及选用的引物与其他细菌有交叉序列而导致假阴性和假阳性的发生，使荧光PCR检测技术有一定的局限性。因此，严格无菌操作和保证引物特异性是避免假阳性发生的关键。当提取的DNA链受到破坏时会发生假阴性。
T细胞检测技术基于感染结核分枝杆菌的机体存在结核特异性记忆T淋巴细胞，当再次遇到结核特异性抗原刺激时，转化为效应T淋巴细胞，释放干扰素的免疫原理。这种方法的无菌条件易于达到，外界的污染和干扰很小，且患者处于免疫抑制状态时不影响T细胞检测的敏感性[10]，在诊断结核感染方面具有良好的敏感性和特异性[11]，在免疫低下的个体中具有更高诊断效能，对肺外结核的诊断敏感性较高，对那些不典型的菌阴肺结核及难以获取检测标本的肺外结核、儿童结核病诊断价值很高，在结核病的诊断中作用巨大[11]。
该研究荧光PCR技术比结核分枝杆菌T细胞检测的敏感性高的结果，与国内文献报道类似[12]，结核分枝杆菌T细胞检测结果达93.3%，特异性比较高，可能是由于该院是专科医院，且来该院的患者经过外院的初步筛查，所有样本患结核的比例本来就较大以及样本数偏少造成的。但综合考虑同时结合荧光PCR技术可达到对结核分枝杆菌准确、快速的检测，在基层结核病的确诊中具有重要的应用价值。
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参考文献
[1] Chen CY, Sheng WH, Cheng A, et al. Clinical characteristics and outcomes of Mycobacterium tuberculosis disease in adult patients with hematological malignancies [J]. BMC Infect Dis, 2011（11）:324.
[2] Jasmer RM, Nahid P,Hopewell PC. Clinical practice.Latent tuberculosis infenction[J]. N Engl J Med, 2002, 347(23): 1860-1866.
[3] 邬艳．荧光定量PCR检测痰结核杆菌特异性DNA序列及其临床应用[J]．中外医学研究，２０１２，10（16）：65-66．
[4] Cui Z，Wang Y，Fang L，et a1．Novel real-time simultaneous amplification and testing method to accurately and rapidly detect Myeobacterium tuberculosis complex [J]．J CIin Mierobioi，2012，50(3)：646-650.
[5] Cruciani M，Scarparo C，Malena M，et a1．Meta-analysis of BACT ECMGⅡ’960 and BACIEC 460 TB．with or without solid media．for detection of mycobacteria [J]．J Clin Mierobiol，2004，42(5)：2321—2325.
[6] 李影林.中华医学检验全书[M].北京：人民卫生出版社，2000.
[7] 邬小薇.三种方法检测结核分枝杆菌的比较[J].重庆医学，2005，34（10）：1506-1507.
[8] Nadine Lematre, Sylvie Armand, Anne Vachee, et al. Comparison of the real-time PCR method and the Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test for detection of Mycobacterium tuberculosis in pulmonary and nonpulmonary specimens[J]. J Clin Microbiol, 2004（42）:4307-4309.
[9] Cordova J, Shiloh R，Gilman RH，et al．Evaluation of molecul ar tools for detection and drug susceptibility testing of Mycobacterium t uberculosis in stool specimens from patients with pulmonary tuberculosis [J]．J Clin Microbiol，2010，48(5)：1820—1826.
[10] Kim SH, Song KH, Choi SJ, et al. Diagnostic usefulness of a T-cellbased assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients[J]. Am J Med, 2009, 122(2): 189-195.
[11] 陈心春，廖明凤，朱秀云，等. 结核菌特异性IFN-γ Elispot检测在活动性结核病和结核感染诊断中的应用[J].中国防痨杂志，2010，32(11)：747-751.
[12] 王鸣，肖新才.目前甲型H1N1流感疫情的防控形势与对策探讨[J].中国预防医学杂志,2009,10（10）：881-882.
（收稿日期：2014-10-23）