杨国雷1 尹松梅2 张复华1 牛国敏1 凌奕文1
1.南方医科大学附属南海医院血液内科，广东佛山 528200; 2.中山大学附属第二医院血液内科，广东广州 510120
[摘要] 目的 探讨GPⅡb/Ⅲa 拮抗剂RGDS和钙通道拮抗剂Nifedipine对ADP诱导的血小板GPⅡb/Ⅲa活化的影响。方法GP II b／11I a特异性抗体PAC-1标记活化GP II b／11I a，流式细胞仪检测静息及 ADP（ 5μmol/L)诱导的血小板PAC-1表达率。结果 静息状态下的血小板PAC-1表达率为(0.80±0.85)％；在ADP（5 μmol/L）激动下，PAC-1表达率为(77.27±9.47) %；RGDS以浓度依赖性的方式抑制PAC-1 表达率，IC50值为206 μmol/L；Nifedipine能以浓度依赖性的方式抑制PAC-1 表达率，IC50值为178 μmol/L；RGDS联合Nifedipine对PAC-1 表达的联合抑制率为（60.15±16.35）％，二者的交互效应差异有统计学意义（P<0.05）。 结论GPIIb/IIIa受体拮抗剂RGDS和Ca2+拮抗剂Nifedipine均抑制ADP诱导的血小板GPIIb/IIIa活化，其抑制作用呈浓度依赖性，随拮抗剂浓度增加抑制作用增强；两者对血小板GPIIb/IIIa活化的抑制存在协同作用。
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关键词 血小板活化；GPⅡb/Ⅲa拮抗剂；钙通道拮抗剂；PAC-1
[中图分类号] R96[文献标识码] A[文章编号] 1674-074２（２０１4）04（a）－０014-02
血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa复合物活化，空间构型改变，暴露纤维蛋白结合位点，是血小板活化的关键。Ca2+是GPⅡb/Ⅲa复合物作为一个完整的功能单位存在的必要因素，同时参与GPⅡb/Ⅲa复合物构型改变及活化[1]。该研究2010年7月—2011年3月期间采用GPⅡb/Ⅲa 拮抗剂RGDS（Arg-Gly-Asp－Ser）和钙通道拮抗剂Nifedipine两种药物，旨在观察二者对ADP诱导的血小板GPⅡb/Ⅲa活化的影响，现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
于该院体检中心体检的健康体检者24人，20～40岁，平均26岁，性别不限，近1个月无用药史；排除冠心病、高血压、糖尿病患者及妊娠女性。空腹 12 h静脉采血， ACD液(1:9)抗凝。
1.2主要试剂及材料
RGDS、Nifedipine、ADP（美国 Sigma）；Mouse IgM：FITC、PAC-1 FITC（FITC标记活化GP II b／11I a特异性抗体），CD61：PerCP，（美国 BDIS）。FACSort型流式细胞仪 （B-D 美国）。
1.3实验方法
1.3.1血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa测定ACD液抗凝静脉血2 mL，分成每份90 μL，加入ADP(5 μmol/L)孵育5min,实验组加入PAC-1：FITC、CD61：PerCP,对照组分别加入Mouse IgM：FITC、 CD61：PerCP 染色，室温下作用20 min ,立即加入2～8℃的％甲醛溶液1 mL,置 2～8 ℃冰箱内固定30 min，24 h内上机检测。每次检测时取5 μL标本，以CD61PerCP/SSC双参数设门,检测PAC-1阳性血小板的百分率[2]。
1.3.2RGDS、Nifedipine单独对血小板PAC-1表达率的作用 制备处理标本同上，静息组不加ADP直接测定， 对照组加入ADP，药物组分别加入5种不同浓度的 RGDS（50、100、200、400、800 μmol/L）,Nifedipine（10、20、40、80、160 μmol/L）于37 ℃ 孵育10 min后加入ADP；其余各步骤相同。
1.3.3RGDS联合Nifedipine对血小板PAC-1表达率的联合作用 制备处理标本同上， 药物组同时加入RGDS（200 μmol/L）及 Nifedipine（160 μmol/L）于37 ℃孵育10 min后加入ADP；其余各步骤相同前。
1.3.4Nifedipine(160μmol/L)和RGDS(200 μmol/L)对血小板PAC-1 表达率的联合作用Nifedipine(160 μmol/L) 对血小板PAC-1抑制率为（44.35±22.81）%；RGDS(200 μmol/L) 对血小板PAC-1 的抑制率为（51.64±17.14）%;二者对血小板PAC-1的联合抑制率为（60.15±16.35）％，经析因设计的方差分析，二者的主效应与交互效应差异有统计学意义（P<0.05）。即二者对PAC-1 表达率的抑制存在协同作用。
1.4统计方法
计量资料的描述用均数±标准差（x±s）表示；PAC-1表达抑制率=[(对照组PAC-1表达率一用药后PAC-1表达率)/对照组PAC-1 表达率]x100％。不同浓度药物的单独效应用随机区组设计的方差分析；联合效应用析因设计的方差分析；所有数据均用spss 16.0统计软件处理。
2结果
2.1ADP诱导的血小板GPIIb/IIIa活化
正常人，静息状态下的血小板PAC-1表达率为(0.80±0.85)％；在ADP（5 μmol/L）激动下，PAC-1表达率增高,为(77.27±9.47) %。
2.2RGDS对血小板PAC-1 表达率的作用
5种不同浓度的 RGDS对PAC-1 表达率均有抑制作用，IC50值为206 μmol/L。随着RGDS浓度的增加，抑制作用增强，经随机区组设计的方差分析及SNK法多重对比，各浓度的效应有统计学意义，即RGDS能以浓度依赖性的方式抑制PAC-1 表达率。
2.3Nifedipine对血小板PAC-1表达率的作用
5种不同浓度的Nifedipine对PAC-1表达率均有抑制作用，IC50 值为178 μmol/L。随着Nifedipine浓度的增加，抑制作用增强，经随机区组设计的方差分析及SNK法多重对比，各浓度的效应有统计学意义，即Nifedipine能以浓度依赖性的方式抑制PAC-1 表达率。
3讨论
血小板活化的早期标志是血小板膜糖蛋白GPⅡb／11a复合物构型从静止状态转变为活化状态。本实验所采用GPIIb/IIIa受体单克隆抗体PAC-1，仅与活化GPIIb/IIIa结合，故其表达率反映GPIIb/IIIa的活化。该研究我们采用以上5个不同浓度的RGDS，发现RGDS能以浓度依赖性地方式抑制PAC-1表达率，随着浓度的增加，抑制率上升。RGDS能够产生上述效应，目前认为与以下方面有关：①GPIIb/IIIa活化的主要途径是依赖蛋白激酶C(PKC)对GPIIIa胞内区Ser/Thr残基磷酸化，产生“内向外”的活化信号实现[3]；RGDS能抑制血小板GPIIb/IIIa受体磷酸化。②GPIIb/IIIa受体拮抗剂能够阻断纤维蛋白原与GPIIb/IIIa结合，能抑制GPIIb/IIIa 活化的“外向内”信号转导途径[4]。Ca2+激活PKC， PKC磷酸化GPIIb/IIIa胞内段及肌球蛋白轻链(MLC)，使GPIIb/IIIa活化[5]。此外，Ca2+与钙调蛋白（CaM）,组成Ca2+－CaM复合物，能激活肌球蛋白轻链激酶（MLCK），MLCK磷酸化MLC，骨架蛋白重组，收缩，使GPIIb/IIIa活化[6]。该研究采用以上5个不同浓度的Nifedipine，发现Nifedipine能浓度依赖性地抑制 PAC-1表达率，随着浓度的增加抑制率增强。
多年来，研究者一直探索血小板GPIIb/IIIa复合物与钙通道的关系。Tetsuro等采用电生理技术研究发现纤维蛋白原与GPIIb/IIIa后，钙内流增加；GPIIb/IIIa复合物解离或GPIIb/IIIa拮抗剂抑制钙内流。血小板膜糖蛋白GP II b／IIIa复合物膜胞内端除可与细胞骨架等结构蛋白结合外，还可与多种信号蛋白如整合素连接激酶(ILK)、蛋白激酶C(PKC) 等结合，对细胞内钙离子浓度的影响，除可通过对细胞膜上钙通道的作用外，也可影响细胞内钙库(如线粒体、 内织网等含钙高的细胞器)的释放[7]。研究发现在GPIIb/IIIa受体拮抗剂RGDS存在的情况下，血小板经凝血酶激活剂作用后的[Ca ]i 升高受到抑制[8]。以上可以看出，GPIIb/IIIa复合物参与调节钙通道活性，但二者具体的关系尚需进一步探讨。该实验观察了200 μmol/L的RGDS与160 μmol/L的Nifedipine对ADP (5 μmol/L)诱导的血小板AC-1表达率的联合效应。发现RGDS与Nifedipine对PAC-1表达率的主效应及交互效应差异有统计学意义(P<0.05)，说明RGDS联合Nifedipine对GPIIb/IIIa活化的抑制存在协同作用。
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（收稿日期：2013-12-24）