摘 要：目的 评价结核病实验室不同检测方法在结核病患者利福平(RFP)耐药快速诊断中的检测效能及应用价值。方法 收集2020年1-7月在该院就诊的肺结核患者痰或肺泡灌洗液标本，采用不同检测方法进行结核分枝杆菌及RFP耐药快速检测，评价不同检测方法在结核分枝杆菌和RFP耐药快速诊断中的检测效能。结果 多色熔解曲线分析(MMCA)法、Gene-Xpert法、微孔板(MIC)法检测均获得RFP药敏试验结果的有77例，77例中3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药率(38.96%、33.77%、35.06%)比较，差异均无统计学意义(P>0.05);不同性别、年龄、菌量标本的患者3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 MMCA法、Gene-Xpert法和MIC法在临床上检测结核分枝杆菌对RFP的耐药性结果无明显差异，均具有较高的灵敏度和特异度，可结合临床实际需求选择药敏药检测技术。
关键词：多色熔解曲线分析 Gene-Xpert 微孔板 肺结核 利福平 耐药
Study on the clinical application of different detection methods in the rapid diagnosis of tuberculosis resistance to rifampicin
BAO Xundi WANG Qing WANG Shu XU Dongfang LIANG Suo JIANG Yue
Department of Clinical Laboratory,Anhui Chest Hospital/Anhui Provincial Institute of Tuberculosis Prevention and Control;
Abstract：
Objective To evaluate the efficacy and application value of different tuberculosis laboratory testing methods in the rapid diagnosis of rifampicin(RFP) resistance in tuberculosis patients.Methods Sputum or alveolar lavage fluid samples from pulmonary tuberculosis patients treated in the hospital from January to July 2020 were collected.Different detection methods were used for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and RFP resistance, and the detection efficiency of different detection methods in rapid diagnosis of Mycobacterium tuberculosis and RFP resistance was evaluated.Results The results of RFP susceptibility test were obtained by multicolor melting curve analysis(MMCA),Gene-Xpert and microplate(MIC) in 77 cases.There was no significant difference in the drug resistance rate of Mycobacterium tuberculosis to RFP(38.96%,33.77% and 35.06%) among the three detection methods(P>0.05).There was no significant difference in the drug resistance rate of Mycobacterium tuberculosis to RFP among patients with different gender, age and bacterial samples(P>0.05).Conclusion MMCA method, Gene-Xpert method and MIC method have no significant difference in the clinical detection of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis to RFP.They all have high sensitivity and specificity.The drug sensitivity detection technology can be selected according to the actual clinical needs.
Keyword：
multicolor melting curve analysis; Gene-Xpert; microplate; tuberculosis; rifampicin; drug resistance;
结核病是一种全球感染人数最多，经呼吸系统传播的疾病，已成为全球十大死亡原因之一。近年来，随着耐药结核病的日益增多，结核病的疫情防控工作从各方面都面临着巨大挑战[1-2]。根据我国第5次结核病流行病学抽样调查和第1次耐药结核病基线调查数据[3-4],我国每年大约新发结核病患者约93万人，估算耐多药结核病患者约5.2万人[5]。有研究指出，耐利福平(RFP)患者大部分为耐多药结核病患者，因此，世界卫生组织(WHO)在耐多药结核病患者中发现，近期耐RFP患者即可按照耐多药结核病患者进行治疗。耐药结核病的诊断主要依赖于结核分枝菌药物敏感(简称药敏)试验，传统的细菌学药敏试验是目前诊断耐药结核病的“金标准”,但传统药敏试验时间长，影响耐药结核病的防控、及时诊断和治疗工作。因此，结核病和耐药结核病的早期快速诊断对结核病疫情控制起着至关重要的作用。
进入21世纪，随着分子生物学检测技术的飞速发展，结核分枝杆菌和RFP耐药基因的快速检测均有成熟易用的技术在推广使用。多色熔解曲线分析(MMCA)法为我国自主研发技术，可同时进行结核分枝杆菌和多种抗结核药物的快速检测[6-7];Gene-Xpert法为WHO推广使用的快速检测技术，同样可同时进行结核分枝杆菌和RFP耐药基因的检测。这两种方法均为DNA扩增检测技术，具有操作相对简单、灵敏度高、特异度高等特点[8-9]。微孔板(MIC)法是近几年报道的一种细菌学药敏检测方法，利用MIC中加入抗结核药物进行药敏检测，可缩短耐药检测时间[10]。本研究采用这3种检测方法对肺结核患者进行结核分枝杆菌和RFP耐药的快速诊断，以评估这3种检测方法在结核分枝杆菌和RFP耐药快速诊断中的检测效能，进一步分析其在结核病和耐药结核病控制中的应用价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2020年1-7月在本院就诊的300例肺结核患者作为研究对象。300例患者中男214例，平均年龄(49.72±19.12)岁；女86例，平均年龄(43.77±20.06)岁。
1.2 仪器与试剂
Gene-Xpert法检测仪器GeneXpert及配套试剂盒购自美国Cepheid公司，MMCA法结核分枝杆菌耐药突变检测仪器SLAN-96S及配套试剂盒购自厦门致善生物科技有限公司，MIC法结核药敏检测仪器YK960及配套试剂盒购自珠海市银科医学工程股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 标本采集
采集肺结核患者的痰或肺泡灌洗液标本，按照结核病实验室标准操作流程采用MMCA法、Gene-Xpert法检测RFP耐药性，同时进行结核分枝杆菌培养，培养阳性菌株再进行MIC法检测RFP耐药性。
1.3.2 结核分枝杆菌和RFP耐药检测方法
(1)MMCA法：取标本1～2 mL,加入1～2倍标本前处理液处理，以12 000×g离心15 min, 磷酸盐缓冲液(PBS)重悬后洗涤，12 000×g离心5 min, 弃上清液，加入核酸提取液，上核酸提取仪进行核酸提取，提取后的DNA按照试剂盒说明书进行检测，由仪器根据核酸解链温度自动判读结果。(2)Gene-Xpert法：取待检标本2 mL,加入1～2倍标本前处理液处理，消化处理15 min后，按照试剂盒操作说明书进行操作，由仪器自动判读结果，结核分枝杆菌半定量检测结果分为阴性、极低、低、中、高5个菌量级别，RFP耐药检测结果分为耐药、敏感。(3)MIC法检测：取患者1～2周内培养阳性菌株，根据操作说明书，将菌株进行比浊定量，加入MIC相应药敏检测位置，37 ℃培养10～14 d后，由仪器判读药敏试验结果。
1.4 统计学处理
将数据录入EXCEL2016,使用spss19.0软件对数据进行统计分析、处理。正态分布的计量资料以x¯±s表示。计数资料以频数、率表示，组间比较采用χ2检验，如理论数T≥5且总样本量n≥40,组间比较采用χ2检验；如理论数T<5但T≥1,且≥40,组间比较采用连续性校正的χ2检验；如理论数T<1或n<40,组间比较则用Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 3种检测方法结核分枝杆菌RFP药敏试验结果
采用MMCA法、Gene-Xpert法、MIC法对300例肺结核患者标本进行检测，MMCA法获得132例药敏试验结果，Gene-Xpert法获得192例药敏试验结果，MIC法获得201例药敏试验结果。3种检测方法均获得结核分枝杆菌RFP药敏试验结果的患者有77例，其中有63例继发性肺结核、12例空洞型肺结核、2例浸润性肺结核；40例为复治结核病患者。3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药率比较，差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。
表1 3种检测方法结核分枝杆菌RFP药敏试验结果
2.2 不同性别患者3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药情况比较
3种检测方法均获得结核分枝杆菌RFP药敏试验结果的77例患者中，男53例，女24例。不同性别患者3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药率比较，差异均无统计学意义(P>0.05),见表2。
表2 不同性别患者3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药情况比较[n(%)]
2.3 不同年龄组患者3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药情况比较
将3种检测方法均获得结核分枝杆菌RFP药敏试验结果的77例患者分为≤25岁、>25～50岁、>50岁3个年龄组。不同年龄组患者3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药率比较，差异均无统计学意义(P>0.05),见表3。
表3 不同年龄组患者3种检测方法结核分枝杆菌 对RFP的耐药情况比较[n(%)]
2.4 不同菌量标本3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药情况比较
将3种检测方法均获得结核分枝杆菌RFP药敏试验结果的77例患者标本按照菌量分为高、中、低、极低菌量4个级别，不同菌量标本3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药率比较，差异均无统计学意义(P>0.05),见表4。
表4 不同菌量3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的 耐药情况比较[n(%)]
3 讨 论
自我国开始结核病的规范化管理治疗以来，结核患者一直能够得到国家规范化的免费抗结核治疗。虽然经过近20年的规范化管理治疗，但我国的结核病患者数量并没有明显下降，目前居全球第2位。随着实验室检测技术的发展，越来越多的耐药结核病患者被发现，结核分枝杆菌耐药株的传播也导致了我国耐药结核病患者数量居高不下[11],使我国成为全球耐药结核病高负担国家之一。RFP是目前结核病治疗中最常用，也是最重要的一种药物。根据WHO的推荐，耐RFP的结核病患者可按照耐多药结核病患者进行治疗，因此，RFP耐药情况检测在肺结核患者中至关重要。
本研究中，3种检测方法均获得结核分枝杆菌RFP药敏试验结果的患者有77例，其中有63例继发性肺结核、12例空洞型肺结核、2例浸润性肺结核；40例为复治结核病患者。由于本院是省级结核病定点医院，收治的多是复治、耐药结核病患者，故本研究中RFP耐药率高于全国平均水平，但与全国复治结核患者RFP耐药率基本一致[4]。
目前，常见的实验室结核分枝杆菌耐药株检测方法有传统的细菌学药敏检测技术、液体药敏检测技术、分子生物学耐药快速筛查等技术[12-15]。传统的细菌学药敏检测技术的缺点是耗时长，但液体药敏检测技术缩短了这一时间，MIC法仅需7～10 d即可报告药敏试验结果。而分子生物学方法1 d内即可获得药敏检测结果，常用的分子生物学检测技术有MMCA法、Gene-Xpert法、线性探针、基因芯片等，它们主要通过检测结核分枝杆菌的特异性靶基因是否存在基因突变来评估结核分枝杆菌对相应药物的耐药性，而且自动化程度高，检测结果与传统细菌学药敏试验结果基本一致，故在临床逐渐被接受和推广。
本研究结果显示，MMCA法检测结核分枝杆菌对RFP的耐药率最高，MIC法次之，Gene-Xpert法最低，但三者的差异均无统计学意义(P>0.05);而且在不同性别和年龄段患者中，结核分枝杆菌对RFP的耐药率差异也均无统计学意义(P>0.05)。对于分子生物学检测，菌量是不可忽视的一个问题，含菌量低的标本可能导致核酸提取的假阴性；而含菌量高的标本，因野生型模板背景较高时，易导致非特异性扩增，产生假阳性结果。这些原因都可能导致表型药敏试验和分子药敏试验结果不一致。基于核酸的碱基突变检测也不能完全覆盖所有的基因突变位点，也有可能导致假阴性结果的存在。因此，可以利用分子药敏试验和表型药敏试验互补的检测方法进行药敏试验筛查，提高检测灵敏度和特异度。本研究中结果显示，不同菌量标本3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药率差异无统计学意义(P>0.05),这可能与样本量较少有关，后期可以加大样本量进行研究，进而发现分子药敏试验和表型药敏试验之间的差异。
MMCA法和Gene-Xpert法均是通过检测RFP的rpoB基因上的507～533共81 bp耐药决定区的基因序列，通过检测碱基突变来确定RFP的耐药信息，与传统的细菌学药敏试验相比，有较好的一致性，且灵敏度和特异度均较高，能够在短时间内检测出RFP的耐药基因rpoB的突变信息。MIC法是通过抗结核药物技术处理后按照一定的药物浓度加入MIC中，再加入一定量的结核分枝杆菌，经过一定时间的培养，从而判断结核分枝杆菌是否对该药物耐药的一种新型细菌学耐药检测技术[16]。该方法受MIC加工工艺和药粉质量的影响，对药敏试验结果可能会存在一定的影响，因此，目前应加强MIC的质量控制工作。本研究在药敏试验检测过程中，参加了中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室的药敏试验室间质量控制，取得了优秀成绩，但此次质量控制覆盖的药物种类较少，主要是常见的抗结核药物，质量控制药物较少，这也是结核分枝杆菌药敏试验检测室间质量控制的发展方向。
此外，MMCA法、Gene-Xpert法、MIC法3种方法在检测时间、检测费用、人力成本方面也有区别，3种方法都是结核分枝杆菌的新检测技术，需要经过培训的专业技术人员进行操作。MMCA法和Gene-Xpert法是分子生物学检测技术，检测时间均短于细菌学检测技术MIC法；检测费用Gene-Xpert法最高，MIC法最低。这3种方法需要临床医生根据患者病情和其他多方面因素进行选择，并可在耐多药结核病防治领域中进行推广和应用[17]。
综上所述，MMCA法、Gene-Xpert法和MIC法在临床上检测结核分枝杆菌对RFP的耐药性结果无明显差异，均具有较高的灵敏度和特异度，可结合临床实际需求选择药敏检测技术。
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