张 鹏 薛朝霞 王春燕 方爱莉 杨春艳 孟永生 师 瑾
山西医科大学附属第一医院麻醉科，山西太原 030001
[摘要] 目的 观察不同程度低血压对双侧颈动脉中度狭窄家兔海马CA1区Caspase-3、Bcl-2、Bax表达的影响，结合其行为学表现探讨低血压对其脑组织的损伤作用。方法 选择健康雄性家兔24只，完全随机法分为6组，每组4只，除了K组（空白对照组）外，其余20只在成功建立双侧颈动脉中度狭窄模型24h后，将其随机分为D组（单纯狭窄组）、X1组（硝酸甘油1组）、X2组（硝酸甘油2组）和B1组（丙泊酚1组）、B2组（丙泊酚2组），X1、X2组和B1、B2组通过硝酸甘油、丙泊酚分别降低基础血压的10%～15%和15%～20%，使血压波动于基础血压的85%～90%和80%～85%之间，维持30 min后补足容量恢复基础血压，继续喂养48 h。72 h将所有家兔断头取脑，做免疫组织化学染色图片，并利用IPP6.0图像分析软件测定其海马CA1区Caspase-3、Bcl-2、Bax的积分光密度值（IOD值）。各组家兔于T1（建立模型前,0h）、T2（建立模型后24 h开始降压前，24 h）及T3（恢复基础血压后48h开始断头前，72h），通过精神状态、反应程度、四肢肌力及饮水摄食情况等方面观察其行为学表现。结果 通过IOD值测量可得：与K组相比，D、X1、B1、X2、B2组阳性表达差异均有统计学意义（P＜0.05）；与D组相比，X1、B1、X2、B2组阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05）；与X1组相比，D1组阳性表达差异无统计学意义，X2、B2组阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05）；与B1组相比，X2、B2组阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05）；与X2组相比，B2组阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05）。各组家兔在T1、T2行为学改变不明显；T3时，K组家兔行为学观察同T1时，D组家兔精神恢复正常，X1、B1组家兔则出现精神稍显萎靡、反应稍显迟钝、四肢肌力减退、活动减少、饮水、摄食活动下降，B2组家兔出现精神萎靡、饮水、摄食减少等表现，而X2组家兔甚至出现嗜睡、进食、饮水很少等表现。结论 降低双侧颈动脉中度狭窄家兔基础血压10%～20%导致Caspase-3、Bax阳性表达增高、Bcl-2阳性表达减少，结合其行为学表现说明其出现早期脑损伤。其中降低基础血压15%～20%两组中，丙泊酚对脑组织损伤较轻，可能与其脑保护作用有关。
[教育期刊网 http://www.jyqkw.com
关键词 ] 颈动脉狭窄；低血压；凋亡；Caspase-3；Bcl-2；Bax
[中图分类号] R743 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）05（b）-0113-02
随着社会老龄化、以及外科和麻醉水平的提高，越来越多颈动脉狭窄患者接受手术治疗，国内外学者发现此类病人易发生术后认知功能障碍（POCD）[1]，POCD是患者出现早期脑损伤的常见临床表现，但现有研究表明：围术期降低血压程度、降低血压持续时间与早期脑损伤的关系尚无定论。本实验从2013年3月—2013年7月，通过观察不同程度低血压对双侧颈动脉中度狭窄家兔海马CA1区Caspase-3、Bcl-2、Bax表达的影响及T1、T2、T3行为学改变，旨在对脑血流动力学变化与脑损伤的相关性作初步探讨，为围术期此类病人的麻醉管理提供参考依据。
1资料与方法
1.1 主要试剂和仪器
Caspase-3多克隆抗体（1:100）、Bcl-2多克隆抗体（1:100）、Bax多克隆抗体（1:100）、HRP标记的抗鼠IgG（1:100）；硝酸甘油注射液，丙泊酚注射液，RM6240系列多道生理信号采集处理系统，光学显微镜。
1.2 实验动物
健康雄性新西兰白兔24只，月龄2～4个月，体重2.0～2.5kg，由山西医科大学实验动物中心提供。
1.3 动物模型建立
用速眠新Ⅱ注射液合剂0.1 mL/kg将家兔麻醉后，仰卧位固定，备皮、铺单后取颈正中切口，小心分离两侧颈总动脉，在环状软骨下1 cm用缝线与0.9 mm塑料管结扎两道，小心抽出塑料管，调整缝线间距为2 mm，形成狭窄处内径等于塑料管的外径。建立模型前后分别由两名超声科医生测量颈动脉内径，其结果符合2003北美放射年会超声会议公布的超声多普勒判定颈动脉中度狭窄的标准[2]，确定模型的成功制备。
1.4 动物分组和干预
24只家兔随机分为6组，每组4只，除了K组（空白对照组）外，其余20只在成功建立模型24 h后，将其随机分为D组（空白对照组）、X1组（硝酸甘油1组）、X2组（硝酸甘油2组）和B1组（丙泊酚1组）、B2组（丙泊酚2组），D组不做降压处理，X1组、X2组和B1组、B2组分别用硝酸甘油、丙泊酚分别降低基础血压10%～15%、15%～20%，使血压波动于基础血压的85%～90%、80%～85%之间，维持30 min后补足容量恢复基础血压，继续喂养48 h。6组家兔于开始降压时行股动脉插管后链接压力换能器，并连接于RM6240多道生理信号采集处理系统，动态监测各组家兔的血压变化情况。
1.5 免疫组化染色
各组动物于72 h后，在深度麻醉下，依次以0.9%的温生理盐水、4%多聚甲醛缓冲液经升主动脉快速灌注后取出脑组织，将全部脑组织置于4%多聚甲醛缓冲液中24 h后进行常规脱水、浸蜡、透明，石蜡包埋后由视交叉开始连续冠状切片（6μm），置于60℃温箱中烤片。根据抗原抗体原理及DAB显色制备海马组织切片。海马CA1区棕色颗粒沉着为阳性细胞，并用IPP6.0图像分析软件检测Caspase-3、Bcl-2、 Bax的积分光密度值（IOD）作为凋亡蛋白表达的相对水平。
1.6 行为学观察
所有动物于T1（建立模型时,0h）、T2（建立模型后24 h开始降压前，24 h）、T3（恢复基础血压后48 h，72 h）通过精神状态、反应程度（对疼痛刺激的反应）、四肢肌力（四肢牵拉时的回缩力度）及饮水摄食情况等方面观察其行为学表现。
1.7 统计学方法
应用spss 13.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组家兔生命体征测量与体重结果
测得各组家兔体重、血压差异无统计学意义（P＞0.05），表1。
2.2 免疫组化染色结果
免疫组化染色图片IOD值统计学分析：与K组相比，D、X1、B1、X2、B2组阳性表达差异均有统计学意义（P＜0.05）；与D组相比，X1、B1、X2、B2组阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05）；与X1组相比，B1组阳性表达差异无统计学意义，X2、B2组阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05）；与B1组相比，X2、B2组阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05）；与X2组相比，B2组阳性表达差异有统计学意义（P＜0.05），表2。
2.2 行为学观察结果
K、D、X1、B1、X2、B2各组家兔在T1表现为：精神状态良好、针刺时躲避时间短、牵拉四肢时，四肢回缩有力，饮水摄食活动正常；T2时，K组家兔行为学观察同T1时，D、X1、B1、X2、B2组家兔除精神稍显萎靡外其余观察同T1表现；T3时，K组家兔行为学观察同T1时，D组家兔精神恢复正常，X1、B1组家兔则出现精神稍显萎靡、反应稍显迟钝、四肢肌力减退、活动减少、饮水、摄食活动下降，B2组家兔出现精神萎靡、饮水、摄食减少等表现，而X2组家兔甚至出现嗜睡、进食、饮水很少等表现。表3。
3讨论
大脑80%的血供来自颈动脉，颈动脉狭窄造成前循环障碍，加之围手术期麻醉药物和控制性降压导致的低血压会加重前循环障碍，而皮质高级功能依赖颈动脉系统的正常血液供应，所以前循环障碍是导致术后认知损害（POCD）的主要原因。本实验在建立颈动脉狭窄模型后，使用麻醉药、扩血管药物降低其血压，观察家兔海马CA1区凋亡蛋白和其行为学改变来评估颈动脉狭窄患者围手术期发生早期脑损伤的风险。
神经细胞对缺血、缺氧耐受力差，如果缺血程度轻、持续时间短则导致细胞凋亡。海马CA1区锥体细胞对缺血特别敏感并且其表达高峰发生在损伤后的48～72h[3]，故本实验观察72h海马CA1区凋亡蛋白。细胞凋亡过程中，Bcl-2家族起着至关重要的作用，其中Bcl-2可以阻止细胞凋亡，而Bax则可以促进细胞凋亡，且近期研究发现：Bcl-2和Bax除与自身表达的高低外，还与Bcl-2/Bax的比率有关，当比率降低时细胞趋于死亡[4]。通过测量发现，随着低血压程度的增加，Bcl-2的IOD值逐渐降低，Bax的IOD值逐渐升高，且Bcl-2/Bax比值逐渐降低，客观验证了脑损伤的加重。Caspase-3是Caspase级联反应中最关键的效应蛋白酶，也是细胞凋亡的终末剪切酶 [5]，本实验发现，Caspase-3在正常海马中几乎不表达，随着低血压程度的增加，IOD值逐渐增高，也客观说明了脑损伤的加重。
如果家兔发生早期脑损伤，加之代偿时间较短，可出现一定程度的神经行为学改变。经实验发现，T1、T2各组家兔行为改变不明显；T3时，K组与D组家兔的行为表现差别不大，而X1、X2、B1、B2组家兔表现出比K、D组家兔明显的神经损伤行为，说明单纯颈动脉狭窄家兔相对于正常家兔没有造成明显的神经损伤，而降低其基础血压造成了明显的神经损伤，从而客观说明严格控制降压程度对于颈动脉狭窄患者的重要意义。
近年来，大量动物及临床实验都说明了丙泊酚的脑保护效应，其脑保护可能与阻滞钙通道、清除自由基、抑制释放甘氨酸以及激活γ-氨基丁酸受体[6]等有关。实验发现，X2组与B2组在相同降压程度、相同降压时间的情况下，与X2组相比，B2组家兔在凋亡蛋白表达及行为学方面都表现出脑损伤的减轻，也客观说明了丙泊酚的脑保护作用。
本实验通过结扎法制备颈动脉狭窄模型，造模24h后发现与K组相比，D组家兔Caspase-3、Bax的IOD值升高，Bcl-2的IOD值降低，其原因可能为缺少代偿时间，从而人为上加重家兔脑组织的损伤作用；X1、B1组与D组相比，三者IOD值及行为学表现有不同程度的改变，其也可能与缺少代偿时间有关，从而提示代偿时间长短对脑损伤的重要意义。
综上所述，本实验在成功建立家兔双侧颈动脉中度狭窄模型的基础上，用不同药物降低基础血压，通过测量海马CA1区免疫组化染色图片IOD值、观察家兔行为学改变，说明，双侧颈动脉中度狭窄家兔在降低基础血压10%～20%时，出现早期脑损伤，且随着低血压程度的加重，脑损伤也相应加重，与本课题组中血清S100β和NSE的浓度变化的结果有很好的呼应。但X1组和B1组在海马CA1区免疫组化染色图片IOD值的测量上差异无统计学意义，可能与样本例数少或早期脑损伤程度较轻有关，尚需进一步探讨。本课题组的相关临床实验也在进行中。
[教育期刊网 http://www.jyqkw.com
参考文献]
[1] 向静, 张涛, 周华东.老年颈动脉狭窄与认知功能障碍的相关研究[J]. 中华临床医师杂志, 2011, 5(6): 1575-1578.
[2] 赵颖,谭泽锋,徐安定.欧洲血管外科学会指南：第二部分颈动脉狭窄患者的诊断和检查[J].国际脑血管病杂志, 2011,19(7):488-497.
[3] 张学军,任光阳,刘涛.脑出血家兔模型血肿周围脑组织细胞凋亡与c-fos表达水平的关系[J].中国老年学杂志，2013,33(4):875-876.
[4] 邓琳, 隋海静, 杨雪. 丙泊酚对大鼠心肌缺血再灌注损伤时凋亡蛋白Bax、Bcl-2的影响[J].哈尔滨医科大学学报, 2013, (3): 45-47.
[5] 沈杰，罗永杰. Caspase-3在缺血性脑损伤中的作用[J].医药前沿, 2012(27):326-327.
[6] 李喆,覃晓.丙泊酚在缺血/再灌注损伤中的保护机制[J].医学综述, 2011,17(3):444-447.
（收稿日期：2014-02-11）