叶扬旻
靖江市人民医院 江苏省靖江市 214500
【摘 要】目的：建立苄星青霉噻唑酸有关物质测定的梯度洗脱HPLC 法。方法：采用端基封尾的C18 柱，流动相A为0.05mol/L 磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH 值至3.1），流动相B 为甲醇，流速1.0mL·min-1，线性梯度洗脱，检测波长220nm，柱温40℃。结果：苄星青霉噻唑酸分别与相邻杂质峰分离完全，检测限为3ng，定量限为11ng。结论：本法专属、灵敏，精密度和耐用性良好，可作为苄星青霉噻唑酸有关物质和色谱纯度的测定方法。
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关键词 苄星青霉噻唑酸; 有关物质
苄星青霉噻唑酸（benzylpenicilloicacids benzathide）为苄星青霉素（BenzathineBenzylpenicillin）中的主要杂质，又称杂质C，其结构式收载于欧洲药典和英国药典苄星青霉素的质量标准中。中国药典[1]和国外药典。苄星青霉素有关物质项下均采用不加校正因子的主成分对照法定量。本文参考中国药典苄星青霉素有关物质的检查方法[3] 和有关文献[2,3]，经方法学研究和验证，建立了面积归一化法测定苄星青霉噻唑酸的有关物质和色谱纯度，方法专属、灵敏，精密度和耐用性良好。
1 材料与方法
1.1 仪器及试药
Waters 2695 高效液相色谱仪、Agilent1100 高效液相色谱仪、Agilent 1260 高效液相色谱仪、岛津LC-20AT 高效液相色谱仪。色谱柱：Phenomenex Luna C18(2)(4.6×250mm，5μm)、依利特SinoChromODS-AP (4.6×250mm，5μm)、AgelaVenusil XBP C18(2) (4.0×250mm，5μm)、Discovery SUPELCO(4.6×250mm，5μm)。
苄星青霉噻唑酸为自行研制。磷酸二氢钾为分析纯，甲醇为色谱纯。
1.2 色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（端基封尾）；流动相A 为0.05mol/L 磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH 值至3.1），流动相B 为甲醇，流速为每分钟1.0ml，线性梯度洗脱；柱温为40℃；检测波长为220nm。
1.3 测定法
精密称取本品约10mg， 置10ml 量瓶中， 加乙腈2ml 和甲醇2ml 超声使溶解，用磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾6.8g与磷酸氢二钾1.14g，加水溶解并稀释成1000ml） 稀释至刻度， 摇匀， 作为供试品溶液。分别取供试品溶液及空白溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
1.4 系统适用性
供试品溶液色谱图中，理论板数按苄星青霉噻唑酸峰计算为25010，与相对主峰保留时间1.06 倍处的杂质峰间的分离度为2.3，符合药典要求。
2 结果
2.1 专属性考察
热破坏试验：取样品5mg，置5ml 量瓶中，加乙腈1ml 和甲醇1ml 超声使溶解，用上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，置100° C 水浴中加热30min，放冷，进样。
酸破坏试验：取样品5mg，置5ml 量瓶中，加乙腈1ml 和甲醇1ml 超声使溶解，加1mol/L 盐酸溶液1.0ml， 放置10min，加1mol/L 氢氧化钠溶液1.0ml 中和，用上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，进样。
碱破坏试验：取样品5mg，置5ml 量瓶中， 加乙腈1ml 和甲醇1ml 超声使溶解，加1mol/L 氢氧化钠溶液1.0ml，放置10min， 加1mol/L 盐酸溶液1.0ml 中和，用上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，进样。
降解产物峰与主峰，降解产物峰之间均分离良好。
2.2 检测限和定量限
精密称取本品10mg，置10ml 量瓶中，加乙腈2ml 和甲醇2ml 超声使溶解，用上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀。精密量取适量，分别用上述磷酸盐缓冲液稀释制成系列浓度的溶液，注入液相色谱仪。以信噪比S/N 为3 时，注入仪器的量确定检测限为3ng。以信噪比S/N 为10 时，注入仪器的量确定定量限为11ng。
3 精密度试验
3.1 重复性
取本品，依法测定6 次，按面积归一化法计算苄星青霉噻唑酸的色谱纯度，平均值为99.52%， 相对标准偏差为0.04%（n=6）。按面积归一化法计算杂质总和，平均值为0.48%（n=6）。
3.2 中间精密度
不同实验人员，在不同实验日期，采用不同厂牌的高效液相色谱仪和色谱柱，同法测定6 次，色谱纯度平均值为99.67%（n=6），相对标准偏差为0.02%。杂质总和平均值为：0.33%（n=6）。
4 耐用性考察
分别采用Waters 2695、Agilent 1100、Agilent 1260、岛津LC-20AT 四种型号高效液相色谱仪， 依利特SinoChrom、Agela Venusil XBP 、Phenomenex Luna 、Discovery SUPELCO 四种厂牌色谱柱，流动相的甲醇比例在±5%，缓冲盐溶液的pH值在3.1±0.1，流速在1.0±0.2 mL?min-1，柱温在40±5° C 范围内变动，对破坏样品、样品进行测试，结果主峰分别与相邻杂质峰均有良好的分离。
5 讨论
色谱柱的选择: 由于二苄基乙二胺及其有关物质可能在制备或降解过程中引入或产生，作为苄星青霉噻唑酸中的杂质，其分子中的碱性基团易与色谱柱的残留硅醇基形成氢键，造成色谱峰严重拖尾甚至吸附，故应选用端基封尾完全的C18 柱，有利于杂质检出。
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参考文献
[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 北京: 中国医药科技出版社,2010:307-308.
[2] 苏倩, 雷勇胜, 刘小琳等. 药物中杂质对照品的标定项目与纯度测定方法研究进展[J]. 现代药物与临床,2012,27(2):150-154.