胡武杰 刘志明 吴斯敏 全军利 李建林
广西医科大学胃肠腺体外科 广西壮族自治区南宁市 530021
【摘 要】目的：通过RNA 干扰乳腺癌MCF-7 细胞组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）基因, 观察对其细胞周期及细胞生长的影响。方法：将乳腺癌MCF-7 细胞分成3 个组：空白对照组( 不予任何处理)、阴性对照组（予以阴性siRNA+ 脂质体）、siRNA 组(HDAC1siRNA+ 脂质体）。人工合成针对HDAC1 基因的小分子干扰RNA 构建HDAC1-siRNA 重组质粒，通过脂质体转入乳腺癌MCF-7 细胞。用Real Time-PCR 法和Western-blot 法分别检测HDAC1 基因的mRNA 及蛋白表达情况；MTT 法检测细胞增殖情况；流式细胞术检测细胞周期变化。结果：转染24h 后人乳腺癌MCF-7 细胞中HDAC1mRNA 表达量在siRNA 组为(0.15±0.02）、空白对照组为（1.00±0.03）、阴性对照组（0.83±0.04）。与空白对照组和阴性对照组相比，siRNA 组细胞中HDAC1mRNA 表达量下降明显（P<0.05）。Western blot 显示HDAC1 蛋白表达量亦明显显示：siRNA 组表达量比空白和阴性对照组低（P<0.05）。MTT 法检测显示3 组细胞中，siRNA 组的细胞生长速度较其他两组慢（P<0.05）。
流式细胞术检测显示3 组乳腺癌细胞细胞周期分布显示siRNA 组细胞周期S 期明显减少（P<0.05），G1 期比例增加（P<0.05）。
结论：通过RNA 干扰能有效的抑制人乳腺癌MCF-7 细胞HDAC1 的表达，同时抑制细胞增殖、引起细胞周期停滞。
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关键词 HDAC1；细胞增殖；细胞周期
组蛋白乙酰化转移酶(HAT) 和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)，是一对功能相互拮抗的蛋白酶，共同负责调控组蛋白的乙酰化与去乙酰化。正常细胞体一旦出现核内组蛋白乙酰化与去乙酰化的失衡，即会导致正常的细胞周期与细胞代谢行为的改变而诱发肿瘤。已有研究表明[1]，由于这对拮抗酶活性的改变，导致组蛋白在转录水平异常修饰，导致异常表达。
在组蛋白去乙酰化酶众多亚型中，HDAC1 在肿瘤的发生发展的关系中是具有代表性的[2]。同时发现HDAC1 的表达水平与患者生存率，肿瘤的大小有关[3]。因此HDAC1 可以作为一个独立的乳腺癌临床预后指标。其机制可能因为下调HDAC1后，是HDAC1 mRNA 和蛋白表达量减少。
本实验旨在通过RNA 干扰的手段，下调乳腺癌MCF-7 细胞中HDAC1 基因的表达, 使HDAC1 基因表达减少，从而抑制细胞增长、使细胞周期发生改变。
1 材料与方法
1.1 细胞及主要试剂
乳腺癌MCF-7 细胞（上海生物工程公司）。DMDM（美国Gibco 公司）；小鼠抗人HDAC1 单克隆抗体及羊抗小鼠二抗购自（美国SANTA CRUZ）公司；脂质体LipofectamineTM2000 购自Invitrogen 公司；Real Time-PCR 检测试剂盒购自（上海吉马技术制药有限公司）公司；胎牛血清购自（维森特生物技术有限公司）公司；双抗购自Gibco 公司。
1.2 主要的设备
CO2 培养箱（3111, 美国Thermo）、超净工作台（苏州净化设备有限公司）、常温离心机（3300, 德国Eppendirf 公司）、流式细胞仪（美国BD 公司）、SDS-PAGE蛋白电泳仪（北京六一仪器厂）、PCR 仪（美国Applied Biosystems 公司）
1.3 细胞培养
乳腺癌MCF-7 细胞培养于含有10%胎牛血清和1% 双抗的DMEM 培养液中，置于37℃、5%CO2 体积分数的恒温培养箱中培养。
1.4 RNA 干扰片段的合成
siRNA 序列委托上海吉玛公司合成， 同时合成随机性阴性对照序列。HDAC1siRNA 正义链：5′ -GCUCCUCUGACAAACGAAUTT-3′，反义链5′ -AUUCGUUUGUCAGAGGAGCTT-3′。阴性的siRNA 正义链5′ -UUCUCCGAA CGUGUCACGUTT-3 ′ 反义链5′ -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。RNA 干扰具体转染步骤参照上海吉玛公司转染操作手册。转染6 ～ 7h 后换成无双抗的DMEM 培养液，之后常规培养，转染24 小时后做后续处理。
1.5 Real Time-PCR 法检测乳腺癌HDAC1细胞中HDAC1 的表达
搜集转染后各组HDAC1 细胞，采用Trizo 法提取总RNA，逆转录为cDNA，以cDNA 为模板，检测HDAC1、β-actin 的表达。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。β-actin 为内参照计算相对表达量(RQ)
1.6 Western blot 法测MCF-7 细胞中HDAC1 蛋白的表达
提取并分离各组总蛋白，将分离后的蛋白转移至硝酸纤维膜上，封闭转移膜，分别加入一抗（兔抗人HDAC1 多克隆抗体以及β-actin 单克隆抗体）反应过夜，随后加入二抗反应2 小时暗室发光显影。以Quantity One v462 图像分析软件对图像进行分析，以目的条带与β-actin 灰度值的比值作为蛋白表达相对含量。
1.7 细胞增殖检测
采用MTT 法进行细胞增殖检测。取对数生长期的MCF-7 细胞，接种在96 孔培养板上， 每孔细胞数1×105/ 孔。实验各组每组设5 个平行孔。分别转染各组。
于转染后(0h、24h、36h、48h、72h、96h) 向每孔加入5mg/μlMTT 溶液20μl。
避光培养4 小时，吸除上清液。每孔加入150μlDMSO，震荡10 分钟，使形成的晶体充分溶解。测定570nm 处吸光度(A) 值,根据A 值绘制细胞生长曲线。
1.8 流式细胞术检测细胞周期变化收集各组转染后的细胞，制备单细胞悬液，调整细胞密度为1×106 个/mL；收集各组细胞，随后用70% 冰乙醇溶液分散固定细胞；PBS 洗涤后弃上清液，加入1%Triton X-100、0.01%RNase 和0.005%PI的混合液，摇匀后静置25min, 用400 目丝网过滤后上机分析，检测细胞周期。
1.9 统计学分析
统计分析采用spss13.0 统计软件包完成，计算资料组间差异，采用方差分析（ANOVA），组间两两比较采用S-N-K 检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Real-Time PCR 结果
HDAC1siRNA 转染乳腺癌细胞36 小时后，提取三组细胞的总RNA，以Real-TimePCR 检测扩增曲线。空白对照组、阴性对照组、siRNA 转染组的表达量分别为（1.00±0.03）、（0.83±0.01）、（0.15±0.002）。与空白对照组和阴性对照组相比，siRN 转染组细胞HDAC 表达量明显降低(P<0.05)。
表明细胞转染HDAC1siRNA 后HDAC1mRNA 表达水平明显降低。
2.2 Western blotting 检测HDAC1 蛋白的表达
Western bloting 结果显示：在空白对照组、阴性对照组、siRNA 转染组的三个组中，siRNA 转染组的HDAC1 基因明显下调，相比另外两组条带亮度明显要弱，参照GADPH，灰度分析显示下降了59%，而空白对照组和阴性对照组的HDACI 基因无明显变化，表明转染的反义基因有效的下调了HDAC1，阻断了其表达，如图1所示。
2.3 细胞增殖检测
HDAC1siRNA 瞬间转染对乳腺癌MCF-7 细胞株增殖的影响。以MTT 法检测乳腺癌MCF-7 细胞株瞬间转染HDAC1siRNA 24h、36h、48h、72h 后细胞的生长情况，与空白对照组和阴性对照组比较，siRNA 组细胞的生长明显变慢（P<0.05），但空白对照组与阴性对照组无明显差异（P>0.05）。提示下调HDAC1的表达后，细胞的生长受到抑制。
2.4 细胞周期检测
转染乳腺癌细胞36 小时后，用流式细胞术检测3 组不同细胞周期的变化。如下表所示，与空白对照组与阴性对照组相比，通过RNA 干扰下调HDAC1 的表达，细胞周期出现了明显的变化，呈现G1 、G2 期阻滞、S 期减少，表明通过通过RNA干扰下调HDAC1 的表达，有效的改变了siRNA 转染组的细胞周期（P<0.05）。
3 讨论
在所有HDACs 中，HDAC1 与肿瘤的关系具代表性，有研究者在肺腺癌、胃癌、HL-60 细胞、胰腺癌、妇科肿瘤证实RNA干扰HDAC1 基因， 可以下调HDAC1 的表达，随之诱导细胞凋亡，抑制增殖[4-5]。由于组蛋白乙酰化异常导致肿瘤的发生，导致转录水平发生异常，因此以此作为靶点治疗是一种全新的治疗途径。
通过实验将HDAC1 基因沉默后，可引起癌细胞有丝分裂减少，细胞凋亡增多，同时细胞的生长受到一定程度的抑制，停滞在G1 或G2M 期[6]。Silvia 等[7] 证明人肿瘤细胞缺乏HDAC1不能进行有丝分裂，而是通过Caspase-3 激活途径进入凋亡，同时细胞周期停滞在G1 期或G2/M 过渡期，从而抑制肿瘤细胞的生长，故剔除HDAC1的表达能抑制肿瘤生长。
在乳腺癌的实验研究中，有人通过正向干预HDAC1，结果显示组蛋白去乙醜化酶1(HDAC1) 的表达可促进三阴性乳腺癌细胞的增殖[8]。同时，构建的反义HDACI质粒导入MCF-7 细胞, 通过下调HDAC1基因, 引起了细胞的增殖抑制及周期阻滞,表明HDAC1 在乳腺癌MCF-7 细胞中其乙酞化与去乙酸化修饰可能起重要作用[9]。
本实验旨在通过RNA 干扰的手段，下调乳腺癌MCF-7 细胞中HDAC1 基因的表达, 从而抑制细胞增长、使细胞周期发生改变。转染后发现转染组的HDAC1mRNA表达在干扰后能出现明显的下降（P<0.05），HDAC 基因蛋白的表达亦有明显的下降（P<0.05）, 表明通过RNA 干扰后能有效的阻断了HDACl 的表达。MCF-7 细胞株转染后细胞增长比空白对照组和阴性对照组增长速度明显降低（P<0.05）。提示下调HDAC1 的表达，细胞的生长受到抑制。与空白对照组与阴性对照组相比，通过RNA 干扰下调HDAC1 的表达，细胞周期出现了明显的变化，呈现G1、G2 期比例增高、S 期比例减少，表明通过通过RNA干扰下调HDAC1 的表达，有效的改变了siRNA 转染组的细胞周期（P<0.05）。
综上所述，HDAC1siRNA 能有效抑制乳腺癌MCF-7 细胞株HDAC1mRNA 及蛋白的表达；在体外能有效抑制乳腺癌MCF-7 细胞的生长增殖，诱导细胞周期发生阻滞。本研究提供了HDAC1 在乳腺癌细胞中的选择性作用谱，这为选择性靶基因治疗发展提供了新的有力的途径。但HDAC1 siRNA 抑制乳腺癌细胞增殖、诱导细胞周期阻滞的机制有待进一步研究。
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