摘 要：目的 探讨血清异常凝血酶原(DCP)、甲胎蛋白(AFP)、铁蛋白(Ferritin)和血清淀粉样蛋白A(SAA)联合检测在原发性肝癌(PLC)诊断中的临床应用价值。方法 收集2020年10月至2021年5月自贡市第三人民医院117例肝病患者的临床资料，包括该院门诊及住院PLC患者(PLC组)65例和肝良性病变患者(肝良性病变组)52例，另选取同期在该院体检的健康者35例作为健康对照组。对各组DCP、AFP、Ferritin、SAA水平进行定量检测，并比较各组血清DCP、AFP、Ferritin、SAA水平，分析血清DCP、AFP、Ferritin、SAA水平与PLC患者临床病理特征的关系，同时分析各血清标志物单项检测及联合检测诊断PLC的受试者工作特征曲线下面积(AUC),评价联合检测在诊断PLC中的应用价值，包括灵敏度和特异度。采用Spearman相关分析血清DCP、AFP、Ferritin、SAA之间的相关性。结果 PLC组血清DCP、AFP、Ferritin、SAA水平均高于肝良性病变组和健康对照组(P<0.05),肝良性病变组血清DCP、AFP、SAA水平均高于健康对照组(P<0.05),肝良性病变组血清Ferritin水平与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。血清DCP水平与中国肝癌的分期方案(CNLC分期)呈正相关(P<0.05),血清AFP水平与肿瘤结节大小、有无门静脉癌栓、CNLC分期呈正相关(P<0.05),血清Ferritin水平与肿瘤结节大小、有无门静脉癌栓、有无远处转移及CNLC分期呈正相关(P<0.05)。受试者工作特征曲线分析显示DCP、AFP、Ferritin、SAA单项检测的AUC分别为0.848、0.825、0.706、 0.706。联合检测AUC均比各血清标志物单项检测大，其中AFP、DCP、Ferritin和SAA联合检测AUC最大(0.927),AFP、DCP和Ferritin联合检测灵敏度最高(86.2%),AFP、DCP和SAA联合检测的特异度最高(95.4%)。PLC组血清DCP与AFP呈正相关(r=0.554,P<0.001),血清Ferritin与SAA呈正相关(r=0.361,P=0.003)。结论 血清DCP、AFP、Ferritin、SAA联合检测可提高对PLC的诊断效能，对PLC的早期诊断具有重要的临床价值。
关键词:原发性肝癌;异常凝血酶原;甲胎蛋白;血清淀粉样蛋白A;铁蛋白;
The application value of combined detection of Des-gamma-carboxy
prothrombin,alpha-fetoprotein,ferrin and serum amyloid A in primary liver cancer
HU Chunmei TONG Ling
LIU Xia QIU Shunhua
Depatment of Clinical Laboratory,Third People's Hospital of Zigong City
Abstract：
Objective To investigate the clinical value of combined detection of Des-gamma-carboxy prothrombin(DCP),alpha-fetoprotein(AFP),Ferritin and serum amyloid A(SAA) in the diagnosis of primary liver cancer(PLC).Methods Clinical data of 117 patients with liver disease in Third People′s Hospital of Zigong City from October 2020 to May 2021 were collected, including 65 outpatients and inpatients with PLC(PLC group) and 52 patients with benign liver disease(benign liver disease group),and 35 healthy subjects who underwent physical examination in a hospital during the same period were selected as healthy control group.DCP,AFP,Ferritin, SAA were quantitatively detected in each group, and the serum levels of DCP,AFP,Ferritin, SAA were compared among the three groups, and the relationship between serum DCP,AFP,Ferritin, SAA and clinicopathological features of PLC patients was analyzed.Meanwhile, the ROC-AUC of PLC diagnosed by single detection and combined detection of each serum marker was analyzed.To evaluate the application value of combined detection in diagnostic PLC,including sensitivity and specificity.Spearman correlation was used to analyze the correlation among serum DCP,AFP,Ferritin and SAA.Results Serum DCP,AFP,Ferritin, SAA levels in primary liver cancer group were higher than those in benign liver disease group and healthy control group(P<0.05).Serum DCP,AFP,SAA levels in benign liver disease group were higher than those in healthy control group(P<0.05).There was no significant difference in serum Ferritin levels between benign liver disease group and healthy control group(P>0.05).Serum DCP level was positively correlated with CNLC stage(P<0.05),and serum AFP level was positively correlated with tumor nodule size, portal vein tumor embolus or not, and CNLC stage(P<0.05).The level of serum Ferritin was positively correlated with the size of tumor nodules, the presence of tumor embolus in portal vein, the presence of distant metastasis and the CNLC stage(P<0.05).ROC curve analysis showed that the AUC of DCP,AFP,Ferritin and SAA were 0.848,0.825,0.706 and 0.706,respectively.The area under the curve of the combined detection was larger than that of each serum marker alone.AFP,DCP,Ferritin and SAA had the largest area under the curve of the combined detection(0.927),AFP,DCP and Ferritin combined detection had the highest sensitivity(86.2%),and AFP,DCP and SAA combined detection had the highest specificity(95.4%).Serum DCP was positively correlated with AFP in PLC group(r=0.554,P<0.001),serum Ferritin was positively correlated with SAA(r=0.361,P=0.003).Conclusion Serum DCP,AFP,Ferritin and SAA combined detection is better than single detection in the diagnosis of primary liver cancer.Different combinations should be selected according to the needs of clinical situations.Combined detection of multiple serum markers can improve the early diagnosis rate of primary liver cancer.
Keyword：
primary liver cancer; Des-gamma-carboxy prothrombin; alpha fetoprotein; serum amyloid A; ferritin;
原发性肝癌(PLC)是全世界最常见的消化道恶性肿瘤之一，在癌症致死病因中居第3位[1]。PLC起病较隐匿，早期并没有明显的临床症状，主要依靠影像学检查和肝穿刺活检确诊，大多数患者在确诊时已是中晚期，因其侵袭性强、进展快、预后差，严重危害人们的健康。甲胎蛋白(AFP)自20世纪70年代开始被用于PLC的筛查和诊断[2],被认为是PLC诊断和预后判断的首选血清标志物。然而，长期的临床实践表明，30%～40%的PLC患者AFP呈阴性，而部分肝硬化、慢性肝病等非PLC患者其AFP水平呈不同程度的升高[3]。因此，为了提高肝癌早期诊断的效率，迫切需要寻找新的血清学标志物补充AFP的不足。异常凝血酶原(DCP)是美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市的血清标志物[4],它是一种无凝血功能的蛋白质称，当肝细胞发生癌变时机体因缺乏维生素K、维生素K利用障碍或者存在维生素K拮抗剂而大量合成。铁蛋白(Ferritin)作为人体内的储铁蛋白质，主要分布在肝和脾等脏器中，一些恶性肿瘤如肝癌等其癌细胞能合成和分泌大量Ferritin, 从而导致血清Ferritin水平升高。血清淀粉样蛋白A(SAA)主要由肝细胞合成，具有亲脂性，是一种载脂蛋白，可与血清中高密度脂蛋白部分结合并构成全身性纤维蛋白前体，在慢性炎症或肿瘤条件下升高[5]。本研究通过收集2020年10月至2021年5月自贡市第三人民医院117例肝病患者的临床资料，探讨联合检测血清DCP、AFP、Ferritin和SAA对PLC的临床诊断价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2020年10月至2021年5月自贡市第三人民医院117例肝病患者的临床资料，包括本院门诊及住院PLC患者(PLC组)65例和肝良性病变患者(肝良性病变组)52例，另选取同期在本院体检的健康者35例作为健康对照组。 PLC组中男53例、女12例，年龄55～73岁。PLC组按病因分类分为乙型肝炎病毒感染者44例(67.7%)、丙型肝炎病毒感染者8例(12.3%,其中2例与HBV重叠感染)和病因不明者15例(23.1%)。肝良性病变组中肝硬化患者27例、病毒性肝炎患者25例，其中男35例、女17例，年龄51～71岁。健康对照组中男21例、女14例，年龄50～68岁。3组研究对象性别和年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)。具有可比性。
1.2 纳入和排除标准
纳入标准：PLC的诊断符合《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》[6]。慢性乙型肝炎和肝硬化的诊断均符合中华医学会肝病学分会和中华医学会感染病学分会联合修订的《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[7],慢性丙型肝炎的诊断符合《丙型肝炎防治指南(2019年版)》[8],健康对照组查体各项指标正常，排除腹部及全身其他疾病。排除标准：(1)排除全身其他部位或脏器伴有恶性肿瘤；(2)1个月内服用维生素K及维生素K拮抗剂类药物；(3)妊娠及梗阻性黄疸；(4)检测前应用大量头孢类抗菌药物；(5)样本严重溶血或乳糜。本研究经自贡市第三人民医院医学伦理委员会讨论批准后实施。
1.3 仪器与试剂
血清AFP、Ferritin检测采用DXI800全自动化学发光免疫分析仪及其配套试剂(贝克曼公司),血清SAA检测采用AU5811全自动生化分析仪及其配套试剂(贝克曼公司),血清DCP检测采用MQ60全自动化学发光免疫分析仪及其配套试剂(北京热景生物技术股份有限公司)。
1.4 方法
所有受试者空腹8～10 h后次日早晨采集静脉血3 mL,室温静置15～30 min后以4 000 r/min离心5～10 min, 4 h内完成血清AFP、Ferritin、SAA水平测定，其余血清分装后冻存在-80 ℃冰箱内至DCP批量检测。血清AFP、Ferritin、DCP检测采用磁微粒化学发光免疫分析法，SAA检测方法为胶乳增强免疫比浊法，本研究严格按照各试剂说明书进行操作。
1.5 统计学处理
采用spss23.0统计软件进行数据分析。采用Kolmogorov-Smirnov(K-S)检验方法初步分析各组数据是否呈正态分布。用率(%)表示计数资料，行χ2检验。非正态分布数据以M(P25,P75)表示，采用Kruskal-Wallis H检验做多组间的比较，采用Mann-Whitney U检验做组间的两两比较。分别绘制DCP、AFP、Ferritin、SAA的受试者工作特征曲线(ROC曲线),并计算曲线下面积(AUC)以进行诊断效能评价，以约登指数对应的检测值为最佳临界值，联合检测阳性判定标准为其中至少一项结果阳性。相关性分析采用Spearman相关分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 各组血清标志物水平比较
PLC组、肝良性病变组和健康对照组血清DCP、AFP、Ferritin、SAA水平比较差异均有统计学差异(P<0.05); PLC组血清DCP、AFP、Ferritin、SAA水平均高于肝良性病变组和健康对照组(P<0.05)。肝良性病变组DCP、AFP、SAA水平均高于健康对照组(P<0.05),肝良性病变组血清Ferritin水平与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
2.2 血清DCP、AFP、Ferritin、SAA水平与PLC患者临床病理特征的关系
血清DCP、AFP、Ferritin、SAA水平与PLC患者的年龄、性别、肿瘤结节数量均无相关性(P>0.05),血清DCP水平与中国肝癌的分期方案(CNLC分期)呈正相关(P<0.05),血清AFP水平与肿瘤结节大小、有无门静脉癌栓、CNLC分期呈正相关(P<0.05),血清Ferritin水平与肿瘤结节大小、有无门静脉癌栓、有无远处转移及CNLC分期呈正相关(P<0.05)。从表2、3可以看出，随着CNLC分期的增高，血清DCP、AFP、Ferritin水平相应升高(P<0.05),随着肿瘤结节增大或门静脉癌栓的出现血清AFP和Ferritin水平均升高(P<0.05),当肿瘤出现远处转移，血清Ferritin水平高于无转移(P<0.05)。
2.3 血清DCP、AFP、Ferritin、SAA对PLC的诊断价值
以肝良性病变组、健康对照组为对照组，PLC组为病例组，绘制DCP、AFP、Ferritin、SAA诊断PLC的ROC曲线，AUC分别为0.848(95%CI:0.780～0.915)、0.825(95%CI:0.751～0.900)、0.706(95%CI:0.621～0.791)、0.706(95%CI:0.624～0.789)。血清DCP、AFP、Ferritin、SAA诊断早期PLC的最佳临界值分别为27.45 ng/mL、15.64 ng/mL、230.95 ng/mL、8.15 mg/L。见图1。
2.4 各指标单项检测及联合检测对早期PLC的诊断价值比较
单项检测以DCP的AUC最大和灵敏度最高，AFP的特异度最高；联合检测以AFP+DCP+Ferritin+SAA的AUC最大，以AFP+DCP+Ferritin的灵敏最高，以AFP+DCP+SAA的特异度最高。见表4。
2.5 血清DCP、AFP、Ferritin、SAA之间的相关性分析
PLC组血清DCP与AFP呈正相关(r=0.554,P<0.001),血清Ferritin与SAA呈正相关(r=0.361,P=0.003),血清Ferritin与DCP、AFP均无线性关系(r分别为0.180、0.177,P>0.05),血清SAA与DCP、AFP均无线性关系(r分别为-0.020、0.125,P>0.05)。
3 讨 论
PLC的主要致病因素包含乙型肝炎病毒(HBV)和(或)丙型肝炎病毒(HCV)感染、食用黄曲霉素污染了的食物、过度饮酒等，我国以慢性HBV感染为主[6],与HBV感染相关的PLC占据主要地位。一直以来，临床上对PLC的早期筛查主要依靠AFP联合超声检查手段，但是相关研究提示AFP的灵敏度不够高，约1/3的PLC患者AFP检测呈阴性，尤其是处在早期阶段的PLC患者[9]。 AFP也可受某些疾病如急慢性肝炎、肝硬化、某些妇科肿瘤、正常妊娠等的影响而呈现阳性结果。欧美国家在最新的肝癌诊疗指南中已不再推荐AFP作为肝癌的首选筛查与诊断标准。因此，为了降低早期PLC的漏诊率和误诊率，提升患者生存质量，需要寻找新的血清标志物来弥补AFP检测的不足。
DCP是一种新型血清标志物，当肝脏发生癌变时将大量合成并释放入血。有研究报道DCP与AFP水平无相关性，在肝癌诊断中可以起到互补作用[10],但本研究发现PLC患者血清DCP水平与AFP呈明显正相关，分析出现这种差异的原因可能是纳入病例多为中晚期而早期肝癌偏少，待收集更多各个分期的肝癌病例以进一步分析两者之间的相关性。同时还观察到，PLC组患者血清DCP水平明显高于肝良性病变组和健康对照组，且随着肿瘤分期的增加DCP水平明显升高，表明DCP能对肝脏病变的良恶性及恶性程度进行较好地鉴别。通过分析ROC曲线，得出DCP的AUC最大和灵敏度最高，AFP的特异度最高，说明单项检测时DCP对PLC的诊断价值相比其他指标更大。胡仁智等[11]通过对56例PLC患者进行研究指出，在单项检测诊断PLC时AFP的灵敏度最高，DCP的特异度最高，与本研究结果相反，可能与研究的样本量偏小有关。血清Ferritin在临床中应用已久，可用于早期PLC诊断，当肝癌细胞受损或破坏时其被大量释放入血。通过研究发现，PLC组的血清Ferritin水平明显高于肝良性病变组和健康对照组，且随着肿瘤结节增大、门静脉癌栓的出现、肿瘤的远处转移及CNLC分期增加，血清Ferritin水平明显上升。有研究报道，将Ferritin与AFP联合检测可提高肝癌预测的准确率，同时术前Ferritin是肝癌根治术后患者生存率的一个重要独立预测因素[12]。SAA是一种炎性介质，属于组织淀粉样蛋白A的前体物质，主要由肝细胞、脂肪细胞、肿瘤细胞分泌。当机体受到感染、炎症、损伤及肿瘤的刺激后，会产生一系列如白细胞介素1、肿瘤坏死因子-α等细胞因子，SAA在细胞因子的调控下表达升高。有研究表明，相比于健康对照组，血清SAA在各种癌症患者中的水平均有不同程度的升高，提示其有可能作为癌症的早期标志物[13]。本研究也证实了PLC患者的SAA水平明显高于肝良性病变组和健康对照组，但SAA与患者的病理特征无明显相关性。SAA与肿瘤细胞的侵袭、转移和血管再生有极其重要的相关性，但其并非肝癌患者所特有，故需配合PLC其他血清指标共同进行检测，才能提高诊断准确性。
近年来，随着越来越多血清标志物被发现，有研究提倡多指标联合检测以提升对PLC早期诊断价值[14,15]。本研究显示，联合检测AUC均比各指标单项检测时大，说明联合检测相比单项检测可能有更好的诊断效能，其中AFP+DCP+Ferritin+SAA联合检测AUC最大，AFP+DCP+Ferritin联合检测灵敏度最高，AFP+DCP+SAA联合检测特异度最高。联合检测结果表明，血清DCP、AFP、Ferritin、SAA联合检测可提高诊断PLC的灵敏度和特异度，临床上应根据情况需要选择不同的组合，多个血清标志物联合检测对提高PLC的早期诊断率有重要价值。本次研究尚存在不足之处，病例数较少，且肝癌的分期不够具体，有待进一步加大样本统计量，通过对各个分期血清标志物水平的分析来评估其在PLC早期监测和预后中的实用性。
综上所述，单项检测时DCP对PLC的诊断价值更大，DCP、AFP、Ferritin、SAA联合检测可进一步提高对PLC的诊断能力，临床应根据情况需要选择不同的检测组合。
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