赵艳霞 张广梅 赵协慧
青海大学医学院中医系，青海西宁 810000
[摘要] 目的 研究高脂饮食对模拟低氧环境SD大鼠主动脉的影响及其可能机制。方法 20只雄性SD大鼠随机分为低氧组和低氧联合高脂饮食组，普通饮食或高脂饮食，4周后留取外周血及主动脉标本，采用TBA比色法检测血浆丙二醛(MDA)含量、WST-1法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力、硝酸还原酶法检测硝酸盐/亚硝酸盐(NOx)水平、终点法和直接检测法检测血脂含量，HE染色观察主动脉病理形态改变，Western blot法检测主动脉内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达水平。结果 病理切片显示低氧组大鼠主动脉内皮细胞肿胀，局部内膜脱落，平滑肌细胞增生，低氧联合高脂饮食组主动脉局部内膜大片脱落，平滑肌细胞明显增生，核变圆，胞浆空泡变明显，细胞排列紊乱。低氧联合高脂饮食组与低氧组主动脉蛋白表达水平无明显变化。与低氧组（75.95±12.48）μmol/L,（0.26±0.0）4mmol/L, （1.55±0.10）mmol/L, （178.79±16.85）U/mL, （6.49±0.87）nmol/mL比较，血浆NOX含量（23.19±7.10）μmol/L明显降低，低密度脂蛋白（0.91±0.04）mmol/L与总胆固醇（2.36±0.22）mmol/L水平明显升高；低氧联合高脂饮食组大鼠血浆SOD活力（163.89±8.16）U/mL与MDA含量（4.31±1.10）nmol/mL显著低于低氧组(P<0.05)。结论 低氧环境下，高脂饮食加重了SD大鼠主动脉损伤，其机制可能与抗氧化能力不足及血脂异常引起血浆NOX水平降低有关。
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关键词 ] 内皮型一氧化氮合酶；一氧化氮；低氧；高脂
[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2014）09（c）-0157-03
内皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化左旋精氨酸产生的一氧化氮(NO)有扩张血管、抑制平滑肌细胞增殖和抑制血小板聚集等作用，可调节血管张力、维持血管稳态，对心血管系统具有多重保护作用，是临床评定内皮功能的重要指标[1]。高脂血症可降低常氧环境机体NO的生成与生物利用度，减弱其对血管的保护作用，引起内皮损伤，平滑肌细胞增殖，启动心血管疾病的发生与发展[2]。高脂血症对低氧环境人群主动脉存在怎样的影响尚不明确。本研究通过观察SD大鼠主动脉病理形态变化、检测主动脉eNOS蛋白表达及血浆硝酸盐/亚硝酸盐(NOx)含量(间接反映NO含量)，探讨高脂饮食对模拟低氧环境机体主动脉的影响及其机制。
1资料与方法
1.1一般资料
1.1.1实验动物 2012年9月22日—10月26日，将20只体重180～200 g的6周龄清洁级Sprague-Dawley (SD)大鼠(雄性，中国药科大学提供)随机分为两组：低氧(H)组与低氧联合高脂饮食(H+HFD)组，每组10只，于低压氧舱模拟海拔5000 m。H+HFD组大鼠灌服脂肪乳剂，10 mL/kg/d，1次/d；H组大鼠灌服等体积生理盐水，普通饮食。于4周末抽取大鼠静脉血，置于抗凝管，并留取主动脉标本于-80℃冰箱保存。
1.1.2脂肪乳剂 采用前期研究的方法制备脂肪乳剂[3]。
1.1.3主要仪器和试剂 冷冻离心机、DU800核酸蛋白仪(德国BECKMAN)，低压氧舱室(贵州风雷航空机械有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及一氧化氮(NO)试剂盒由南京建成生物公司提供，血脂检测试剂盒、BCA蛋白分析试剂盒、eNOS及β-actin一抗、二抗分别由北京利德曼生化股份有限公司、Pierce Chemical Company、Abcam公司、Santa Cruz Biotechnology lnc提供。
1.2方法
1.2.1主动脉病理形态观察 取主动脉标本固定，脱水，包埋，切片，HE染色，观察病理形态改变。
1.2.2血浆SOD活力和MDA含量测定 于3000 r/min离心抗凝血（10 min），分离血浆。用WST-1法、TBA比色法分别检测血浆SOD活力及MDA含量。
1.2.3血脂水平检测 采用直接测定法检测血浆高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量，采用终点法检测血浆总胆固醇(TCH)及甘油三酯(TG)含量。
1.2.4血浆NOX水平检测 采用硝酸还原酶法检测血浆NOX水平。
1.2.5 主动脉eNOS蛋白水平检测 将主动脉切成小块，裂解组织，匀浆，离心，取上清，检测样品总蛋白浓度。用5×蛋白上样缓冲液于100 ℃变性5 min。采用12%SDS-PAGE电泳分离蛋白。使用半干转印槽将蛋白转印至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉在室温下封闭2 h，然后加兔抗eNOS (1:250)，β-actin (1:1000)，4℃孵育过夜。于洗膜后用辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(1:6000)室温孵育2 h，使用ECL液发光显影。胶片扫描后用ImageJ软件分析，计算目的与内参条带积分光密度值的相对比值。
1.3统计学方法
应用spss 17.0统计软件包，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验，检验水准α=0.05。
2结果
2.1主动脉病理形态变化
H组内皮细胞肿胀，核变圆，局部内膜脱落，平滑肌细胞增生，细胞核变椭圆，局部胞浆疏松，细胞轻度排列紊乱；H+HFD组局部内膜大片脱落，内皮细胞肿胀，平滑肌细胞明显增生，细胞核变圆，胞浆空泡变明显，细胞排列紊乱，见图1。
注:A1 A2为H组，B1 B2为H+HFD组，A1 B1为×100，A2 B2 为×400。
2.2血脂水平检测
H+HFD组LDL、TCH含量明显高于H组，两组间的TG与HDL水平无明显差异，见表1。
2.3血浆MDA含量与SOD活力的测定
H+HFD组MDA含量与SOD活力均明显低于H组，见表2。
2.4血浆NOx水平测定
H+HFD组大鼠血浆NOx含量低于H组，见表2。
2.5主动脉eNOS 蛋白表达水平测定
H组(0.82±0.15)与H+HFD组(0.91±0.17)大鼠主动脉eNOS 蛋白表达水平无明显差异(t=-0.885, P=0.402)。
3讨论
本研究通过观察SD大鼠主动脉病理形态变化、检测主动脉eNOS蛋白表达及血浆NOx含量，探讨高脂饮食对模拟低氧环境机体主动脉的影响及其机制。结果显示，相对于低氧组，低氧联合高脂饮食组主动脉病理损伤加重，eNOS蛋白表达水平无明显变化，而血浆NOx含量明显降低，血浆TCH及LDL明显升高；低氧联合高脂饮食组血浆SOD活力低于低氧组，表明高脂饮食可加重模拟低氧环境大鼠主动脉的损伤。
NO是高原适应与习服的重要指标之一，高原世居藏族循环血NO代谢产物高于低海拔人群的水平，可增加血流灌注及氧传递，以抵消低氧影响，而机体NO含量降低则可引起高原适应不良[4-5]。本研究中低氧联合高脂饮食组血浆NOx含量明显低于低氧组，与文献报道一致[6]，即高脂饮食可使模拟低氧环境SD大鼠血浆NO含量降低，减弱了其对血管的保护作用，加重了血管内皮的损伤，导致内膜大片脱落，平滑肌细胞明显增生，细胞核变圆，胞浆空泡变，细胞排列紊乱。另外，血浆NO含量降低还可影响血管内皮细胞功能，使其释放扩血管物质减少，缩血管物质增多，进而加重了血管收缩与重构[7]。提示对于慢性重度低氧性疾病的患者，高脂血症可能是其动脉损伤加重的独立危险因素。
本研究中，低氧联合高脂饮食组大鼠血浆LDL与TCH浓度明显高于低氧组，血脂异常可诱导小窝蛋白，降低eNOS从质膜上解离，降低eNOS的酶活性，即eNOS蛋白表达不降低而NO产生减少原因之一。同时，血脂异常还可引起机体抗氧化能力降低，即抗氧化指标SOD活力降低。减弱其清除机体代谢过程中产生过氧化物的能力，引起eNOS出现无用的代偿性改变，致使eNOS脱偶联[8]，减少NO生成，增加NO清除，降低其生物利用度。既往研究亦证实抗氧化能力不足致血管内皮损伤及内皮源性NO生成减少，补充抗氧化剂可纠正血管内皮损伤[9]。
综上所述，本研究结果表明与单纯低氧相比，联合高脂饮食降低大鼠抗氧化能力，降低血浆NOx水平，加重了主动脉损伤。提示长期高脂饮食可能是慢性重度低氧环境机体主动脉损伤的独立危险因素，其主要原因可能是抗氧化能力降低，应积极干预和治疗。但也有研究认为联合高脂饮食并未加重低氧环境大鼠血管损伤，分析原因可能与低氧的方式、程度及时间不同有关，需进一步研究证实[10]。因大鼠与人体间存在差异，高脂饮食对慢性重度低氧环境人主动脉的影响不能由本研究结果完全反映，有待进一步的研究。
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参考文献]
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（收稿日期：2014-07-10）