摘 要：目的 明确在小鼠肝纤维化发生、发展过程中铁调素(hepcidin)的调控作用。方法 将野生型C57BL/6(WT)小鼠和hepcidin基因敲除(HAMP-/-)小鼠按随机数字表法分为正常对照组(n=10)和四氯化碳(CCl4)组(n=10)。正常对照组小鼠给予橄榄油灌胃,CCl4组小鼠给予25%CCl4(CCl4︰橄榄油=1︰3)灌胃,每周2次,共6周。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测CCl4灌胃1周、4周和6周小鼠血清中hepcidin的水平;通过Masson染色和苏木精-伊红(HE)染色来分别观察CCl4所诱导的小鼠肝脏纤维化严重程度,以及肝内的炎症水平;通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测小鼠肝脏内纤维化相关基因Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)和转化生长因子β(TGF-β)的表达,炎症相关基因白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达,以及凋亡相关基因Bax、Fas、Bcl-xl和Bcl2的表达;最后采用流式细胞术检测hepcidin多肽对CCl4诱导的小鼠肝细胞系NCTC1469细胞凋亡的调控作用。结果 ELISA结果表明,随着肝纤维化进展,小鼠血清中hepcidin水平呈现出逐渐升高的趋势,在6周时最高,与正常对照组小鼠相比,升高约1.9倍,差异有统计学意义(P <0.01)。肝组织病理学结果显示,与WT型CCl4组小鼠相比,HAMP-/-CCl4组小鼠肝纤维化程度和肝脏炎症细胞浸润更严重。qPCR结果显示,与WT型CCl4组小鼠相比,HAMP-/-CCl4组小鼠其肝脏CollagenⅠ、CollagenⅢ和TGF-β的表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P <0.05);促炎性细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6表达水平升高,差异均有统计学意义(P <0.05);促凋亡基因Bax和Fas的表达也呈现出上调趋势,凋亡抑制基因Bcl-xl和Bcl2的表达呈下调趋势,差异均有统计学意义(P <0.05)。流式细胞仪分析结果显示,hepcidin可显著抑制CCl4诱导的小鼠肝细胞系NCTC1469细胞凋亡。结论 Hepcidin可以通过抑制肝脏细胞的凋亡进而抑制肝脏炎症和肝纤维化。
关键词:小鼠;铁调素;肝脏纤维化;肝细胞凋亡;
Effects of hepcidin on liver fibrosis by inhibiting hepatocytes apoptosis
LIU Ying-ying
WANG Xiao-fan LI Chang-ying
Liver Research Center, Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University Beiing Key Laboratory
of Translational Medicine in Liver Cirhosis, National Clinical Research Center of Digestive Diseases
Abstract：Objective To investigate the regulatory effect of hepcidin on mice liver fibrosis. Methods Wild-type( WT) and hepcidin-knockout( HAMP-/-) mice were randomly divided into control group( n = 10) and carbon tetrachloride( CCl4) group( n = 10). The normal control group mice were administered olive oil by gavage,and the CCl4 group mice were administered 25% CCl4( CCl4︰ olive oil = 1 ︰ 3) by gavage twice a week for 6 weeks. Enzyme-linked immunosorbent assay( ELISA) was utilized to detect the level of hepcidin in the serum of mice with liver fibrosis at 0,1,4 and 6 weeks. Masson and Hematoxylin-eosin staining were used to observe mice liver fibrosis and inflammation changes. Quantitative real-time PCR( qPCR) was used to detect the expression of Collagen Ⅰ,Collagen Ⅲ,transforming growth factor-β( TGF-β),interleukin-1β( IL-1β),interleukin-6( IL-6),tumor necrosis factor-α( TNF-α),apoptosis related genes Bax,Fas,Bcl-xl and Bcl2. Finally,flow cytometry was used to confirm the hepcidin regulatory effect on CCl4-induced mice hepatic cell line NCTC1469 apoptosis.Results Serum ELISA result showed that hepcidin was increased gradually. Compared with control mice,the serum hepcidin level in fibrotic mice after 6 weeks CCl4 gavage increased by 1. 9 times,the difference was statistically significant( P < 0. 01). Masson and HE staining showed that the HAMP-/-mice had a more severe collagen deposition and liver inflammatory cells infiltration. QPCR results showed that compared with WT mice after CCl4 administration,the HAMP-/-mice after CCl4 administration had higher mRNA expression levels of Collagen Ⅰ,CollagenⅢ,TGF-β,IL-1β,TNF-α and IL-6,the differences were statistically significant( P < 0. 05). Compared with WT mice after CCl4 administration,the mRNA level of apoptosis-related genes Bax and Fas expression were higher but Bcl-xl and Bcl2 expression were lower in those of HAMP-/-mice,the differences were statistically significant( P < 0. 05). Flow cytometry result showed that hepcidin can inhibit CCl4-induced mice hepatic cell line NCTC 1469 apoptosis in vitro. Conclusion Hepcidin can suppress liver inflammation and fibrosis through inhibiting hepatocytes apoptosis.
Keyword：Mice; Hepcidin; Liver fibrosis; Hepatocyte apoptosis;
慢性病毒感染、过度饮酒等不同因素作用于肝脏均会导致肝纤维化的发生，如不及时去除病因可进一步导致肝硬化和肝癌的发生[1]。肝脏中最主要的实质细胞—肝细胞是肝脏受到损伤时的主要靶细胞。研究发现，抑制肝细胞凋亡可减轻肝脏炎症水平以及减少肝癌的发生[2]。当细胞发生损伤坏死时，C型凝集素受体2d与组蛋白序列识别结合后可导致巨噬细胞促炎性细胞因子的释放[3]。巨噬细胞以及参与肝脏炎症反应的其他细胞，如T淋巴细胞、中性粒细胞和树突状细胞等，可进一步活化胶原生成细胞-肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)[4]。由此可见，肝细胞发生凋亡后可通过启动肝脏炎症，并进一步使肝脏发生纤维化。因此，通过抑制肝细胞凋亡来实现对肝纤维化的抑制作用具有一定的治疗意义。
铁调素(hepcidin)主要是由肝细胞合成的多肽，它通过降解位于肠细胞和巨噬细胞表面的膜铁转运蛋白来发挥调节血清铁的作用[5,6]。除参与调节铁代谢外，hepcidin也可通过抑制HSCs的活化而发挥一定的抗纤维化作用[7]。本课题组的前期研究发现，四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导的急性肝损伤模型中，与野生型(wild type,WT)小鼠相比，hepcidin基因敲除(HAMP-/-)小鼠肝损伤程度及肝细胞凋亡均更严重[8]。肝细胞凋亡作为一种重要的肝脏炎症和纤维化的始动因素，hepcidin是否会通过调控肝细胞凋亡进而调控肝脏炎症及肝纤维化尚待明确。
因此，本课题拟对WT小鼠和HAMP-/-小鼠通过灌胃建立CCl4肝纤维化模型，体内观察hepcidin对于小鼠肝脏纤维化以及炎症水平的调控作用;此外，在体外实验中，通过流式细胞术来观察hepcidin预处理是否会对CCl4诱导的小鼠肝细胞系NCTC 1469细胞的凋亡产生影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级C57BL/6品系小鼠，雄性，8周龄，体重18～22 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号为1103222011009820。HAMP-/-小鼠由法国国家科学研究中心Sophie Vaulont教授和美国加州大学Tomas Ganz教授馈赠。所有实验动物均经过首都医科大学附属北京友谊医院动物伦理委员会批准。动物分笼饲养于首都医科大学附属北京友谊医院动物室，温度25℃左右，相对湿度50%左右，每日光照12 h。C57BL/6小鼠用普通饲料喂养，HAMP-/-小鼠用低铁饲料(20 ppm︰4 ppm=1︰2)喂养，去离子水自由饮用。
1.2 试剂与仪器
CCl4(天津益仁达化工有限公司)，戊巴比妥钠(北京化学试剂公司)，通用型组织固定液(武汉谷歌生物科技有限公司)，Masson三色染色液(珠海贝索生物技术有限公司)，小鼠血清hepcidin检测试剂盒(美国cloud-clone corp公司)，Trizol(美国Sigma公司)，逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)，POWERSYBR GREEN PCR Master Mix(美国Applied Biosystems公司)，实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)(美国Bio-Rad公司)，小鼠肝细胞系NCTC1469细胞购买于中国医学科学院基础研究所基础医学细胞中心，胎牛血清(美国Gibco公司)，100 IU/m L青霉素、100 mg/m L链霉素、DMEM(美国Hyclone公司)，小鼠hepcidin多肽(美国peptides international公司)，异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-膜联蛋白V(Annexin V)检测试剂盒(美国BD Pharmingen公司)，Novocyte 1040小型流式细胞仪(北京艾森生物科技有限公司)，-80℃及-20℃冰箱(海尔集团有限公司)，离心机(德国Eppendorf公司)。
1.3 小鼠CCl4肝纤维化模型的建立及取材
WT小鼠和HAMP-/-小鼠均按照随机数字表法分为正常对照组(n=10)和CCl4组(n=10)。正常对照组小鼠给予橄榄油灌胃，CCl4实验组小鼠给予25%CCl4(CCl4︰橄榄油=1︰3)灌胃。剂量为10μL/g，每周灌胃2次。6周后腹腔麻醉，留取小鼠肝组织，眼眶取血后二氧化碳吸入法处死小鼠。
1.4 小鼠血清hepcidin检测
眼眶取血法采集血样于1.5 m L的EP管中，将血样于4℃冰箱静置1 h,3 000 g离心20 min，离心结束后，吸取上层血清于新的1.5 m L EP管中。然后根据酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒操作说明书，检测血清中hepcidin水平。
1.5 小鼠肝组织病理学观察
造模结束后，留取各组小鼠的肝组织，然后于4%多聚甲醛溶液中固定适宜的时间，结束后依次进行脱水、透明、组织包埋。包埋后的蜡块切片，脱蜡至水。
1.5.1 Masson染色
依次进行苏木精、丽春红酸性品红溶液、磷钼酸、苯胺蓝染色，结束后用0.2%的冰醋酸溶液冲洗切片，至切片无蓝色脱出后脱水透明封片。
1.5.2 苏木精-伊红染色
依次进行苏木精-伊红染色，流水冲洗2 min。脱水透明封片。
1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡
将生长状况良好的小鼠肝细胞系NCTC1469细胞以2.5×105个/孔的密度接种于六孔板中，分别设空白对照组(未处理组)、CCl4刺激组(单纯CCl4刺激12 h)和CCl4+hepcidin组(hepcidin预处理后，CCl4刺激12 h)。次日，待细胞密度达到60%左右时换无血清的培养基继续培养细胞2 h。首先以300 ng/m L的hepcidin多肽预处理细胞30 min，然后用0.25 mmol/L的CCl4作用12 h。将细胞制成单细胞悬液，以1 000 r/min速度(离心半径13.3 cm)离心3min，离心结束后弃上清。加入1 m L预冷的磷酸盐缓冲液清洗2遍，同样以1 000 r/min速度(离心机半径13.3cm)离心3 min后，弃上清。然后使用1×结合缓冲液重悬细胞，随后将2μL碘化丙啶和2μL Annexin V加入该细胞悬液中继续避光孵育20 min。孵育结束后使用流式细胞仪进行相关检测。
1.7 小鼠肝组织总RNA的提取以及q PCR检测
准备好已提前加入Trizaol的2 m L的无酶EP管，造模结束后留取小鼠肝右叶约50 g肝组织放入提前准备好的EP管中。使用匀浆枪使组织充分破碎。使用Trizol法提取小鼠肝组织RNA。待RNA完全溶解后检测其浓度，取500 ng RNA用Ta KaRa试剂盒在普通PCR仪器上逆转录，反应条件为:37℃30 min,85℃5 s,4℃保存。逆转录结束后检测c DNA浓度，稀释成80～120 ng/μL后用PCR SYBR Green mix(2×)以β-actin(上游:5'-CCGTGAAAAGATGACCCAGATC-3'，下游:5'-CA-CAGCCTGGATGGCTACGT-3')为内参，分别检测Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、(上游引物:5'-TAGGCCATTGTG-TATGCAGC-3'，下游引物:5'-ACATGTTCAGCTTTGT-GGACC-3')、Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)(上游引物:5'-GAGAACCTGGTGCAAATGGG-3'，下游引物:5'-CAT-ACCCCGTATCCCTGGAC-3')、转化生长因子-β(transforming growth factorβ，TGF-β)(上游引物:5'-GCCCTGGATACCAACTATTGC-3'，下游引物:5'-GCAGGAGCGCACAATCATGTT-3')、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)(上游引物:5'-CCAGCAG-GTTATCATCATCATCC-3'，下游引物:5'-CTCGCAG-CAGCACATCAAC-3')、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(上游引物:5'-CAGCCGAT-GGGTTGTACCTT-3'，下游引物:5'-TGTGGGTGAG-GAGCACGTAGT-3')、白细胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)(上游引物:5'-AGAGATACAAAGAAATGATG-GA-3'，下游引物:5'-AGCTATGGTACTCCACAAGAC-CA-3')、Bax (上游引物:5'-TGAAGACAGGGGC-CTTTTTG-3'，下游引物:5'-AATTCGCCGGAGA-CACTCG-3')、Fas(上游引物:5'-AGGTGGACTGGAT-ACACAGAC-3'，下游引物:5'-TCTCCTGC-CCAAACTCTTTGC-3')、Bcl-xl (上游引物:5'-CT-GTCCGCAGGCTCTTTCG-3'，下游引物:5'-CCAAG-GCAGGAAGCTGTGT-3')、Bcl2(上游引物:5'-CTTTCTGCTTTTTATTTCATGAGG-3'，下游引物:5'-CAGAAGATCATGCCGTCCTT-3')。反应条件为:50℃︰2 min,95℃︰10 min，然后以95℃︰15 s,60℃︰1 min为一个循环，进行44个循环。反应结束后，通过Ct值(<35)和溶解曲线保证反应特异性的情况下，通过相对定量2-△△Ct法进行数据分析。
1.8 统计学处理
使用spss 19.0软件对数据进行统计学分析，组内及组间比较采用t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CCl4诱导的小鼠肝纤维化过程中血清中hepcidin水平的变化
ELISA结果显示，随着肝纤维化的进展，CCl4灌胃后1、4和6周小鼠血清中hepcidin水平分别为35.13、46.92、48.76 ng/m L，呈现逐渐升高的趋势，并且在肝纤维化6周时达到最高水平，与正常对照组(25.46ng/m L)相比，升高1.4、1.8、1.9倍，差异有统计学意义(t=4.716、15.390、17.730,P<0.01)。见图1。
2.2 Hepcidin对小鼠肝纤维化的保护作用
Masson染色的结果表明，WT型CCl4组小鼠和HAMP-/-CCl4组小鼠均发生了不同程度的纤维化，胶原沉积，纤维间隔形成，其中HAMP-/-CCl4组小鼠胶原沉积更重，形成纤维间隔更宽(图2A)。进一步检测纤维化相关基因CollagenⅠ、CollagenⅢ和TGF-β的表达水平，q PCR结果显示，CCl4作用下，WT小鼠和HAMP-/-小鼠的上述基因均发生了显著的上调，HAMP-/-CCl4组小鼠与WT型CCl4组小鼠相比，CollagenⅠ、CollagenⅢ和TGFβ分别升高2.2倍、2.0倍和2.5倍，差异有统计学意义(t=2.743、2.707、5.923,P<0.05)。见图2B。
2.3 Hepcidin对小鼠肝内炎症反应的抑制作用
HE染色结果表明，CCl4组小鼠肝内汇管区有大量炎症细胞的浸润。HAMP-/-CCl4组小鼠肝脏内的炎症反应更重，炎症细胞浸润也更加明显(图3A)。q PCR结果显示，CCl4可显著诱导肝脏内促炎性细胞因子的表达，与WT型CCl4组小鼠相比，HAMP-/-CCl4组小鼠肝脏内促炎性细胞因子的表达水平更高，IL-1β、TNF-α、IL-6分别升高2.3倍、2.8倍和1.5倍，差异有统计学意义(t=8.406、4.976、12.480,P<0.01)。见图3B。
2.4 Hepcidin对CCl4诱导的肝细胞凋亡的抑制作用
与WT型CCl4组小鼠相比，HAMP-/-CCl4组小鼠促凋亡基因Bax和Fas分别升高2.0倍和8.3倍，差异有统计学意义(t=5.980、5.269,P<0.01);HAMP-/-CCl4组小鼠肝脏抑凋亡基因Bcl-xl和Bcl2则呈现出下调的趋势，与WT型CCl4组小鼠相比，HAMP-/-CCl4组小鼠其抑凋亡基因Bcl-xl和Bcl2分别下降2.2倍和6.8倍，差异有统计学意义(t=2.457、4.129,P<0.01)。见图4。
2.5 Hepcidin抑制CCl4诱导的小鼠肝细胞系NCTC1469细胞的凋亡
流式结果所示，凋亡细胞所占比例在正常对照组、单纯hepcidin处理组、单纯CCl4处理组以及Hepcidin+CCl4处理组分别为9.50%、8.84%、17.48%和7.97%。Hepcidin预处理后，细胞的凋亡比例由17.48%降至7.97%，下降了9.51%。结果表明，hepcidin对于CCl4诱导的肝细胞的凋亡具有一定的抑制作用。见图5。
3 讨论
膜铁转运蛋白主要位于小肠上皮细胞和巨噬细胞表面，是肝脏合成的hepcidin多肽的作用受体，hepcidin通过与其结合来维持系统的铁稳态[5]。除了参与铁代谢外，也有研究表明hepcdin可通过抑制HSCs的活化进而发挥一定的抑制肝纤维化作用[7,8,9]。血清hepcidin已成为肝纤维化和肝硬化的一种新的标志物[10]。本研究结果表明随着小鼠肝纤维化造模时间的不断延长，其血清中hepcidin的水平呈现出逐渐升高的趋势，这可能是由于肝纤维化的加重所引起一种代偿性的增高。为了进一步明确hepcidin是否对于CCl4诱导的肝纤维化具有一定的抑制作用，本研究对WT小鼠和HAMP-/-小鼠分别进行CCl4肝纤维化造模，在通过低铁饮食控制HAMP-/-小鼠血清铁维持在正常水平的情况下，检测小鼠肝组织纤维化相关基因以及促炎性细胞因子的表达水平。结果表明，HAMP-/-经CCl4诱导的肝纤维化程度以及肝脏炎症水平均较严重，初步表明hepcidin具有一定的抗炎及抗纤维化作用。
肝细胞凋亡在多种慢性肝病的疾病进展过程中发挥着重要作用。凋亡的肝细胞会通过生成炎性小体以及细胞因子刺激免疫细胞和HSCs，加速病程进展及恶化[11,12,13]，而抑制肝细胞的凋亡则可以显著降低肝脏炎症以及肝硬化的发生[14]。本研究结果所示，与WT小鼠CCl4组相比，HAMP-/-小鼠CCl4组肝内促凋亡基因表达水平更高，而抗凋亡基因表达降低。体外实验结果表明，hepcidin具有一定的抗细胞凋亡作用，进一步明确了hepcidin对肝细胞凋亡的保护作用。但是本研究仍然存在一定的局限性，需要后期对hepcidin抑制肝细胞凋亡的具体信号通路作进一步阐明。
4 结论
综上所述，本研究显示，hepcidin可通过抑制肝细胞的凋亡进而抑制肝脏的炎症反应和肝纤维化，但是其具体机制仍需进一步明确。Hepcidin或将成为肝纤维化的一种潜在治疗方法，具有一定的临床应用前景。
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