摘 要：目的 寻找解决乙二胺四乙酸依赖性假性血小板减少症(EDTA-PTCP)快速、准确的复检方法。方法 收集18例EDTA-PTCP患者标本，采用手工法、仪器稀释法、仪器稀释阻抗法测血小板法(PLT-I)、仪器稀释光学法测血小板法(PLT-O)检测不同时间点的血小板数量。以手工法为标准，评价其他3种方法的准确率。结果 PLT-I中最准确的方法为采血后0～5 min内上机检测，准确率为77.8%。PLT-O中最准确的方法为采血后0～5 min内上机检测，准确率为100.0%,其次为采血后20 min内上机检测及仪器稀释后0～5 min内采用PLT-O检测，准确率均为77.8%,采血后1 h内检测准确率为56.0%。PLT-O准确率高于PLT-I。结论 针对不是急查血小板计数的EDTA-PTCP患者，推荐采血后0～5 min内采用PLT-O上机检测；对于静脉穿刺较难的婴幼儿和重症患者，推荐采集末梢血仪器稀释后采用PLT-O上机检测；对于急查血小板计数患者，推荐采血后1 h内采用PLT-O上机检测。
关键词：乙二胺四乙酸依赖性假性血小板减少症 光学法测血小板法 血小板聚集
血小板计数在血栓和出血性疾病的诊断和治疗中有重要价值。国际血液学标准化委员会推荐使用乙二胺四乙酸(EDTA)作为血常规检测的抗凝剂，因其对血细胞的形态和血小板计数影响很小，因此被广泛使用[1]。然而EDTA也有其弊端，有时会导致血小板聚集，因为仪器对聚集的血小板不能确认，造成EDTA依赖性假性血小板减少症(EDTA-PTCP)[2]。这种血小板假性减少现象若没有及时发现并纠正，临床上则可能采取非必要的骨髓穿刺、激素治疗或施行脾脏切除术等治疗方案[3]。因此，工作中能及时发现 EDTA-PTCP患者并准确进行血小板计数复检尤为重要。本研究对成都市双流区人民医院医学检验科工作中发现的18例EDTA-PTCP患者，采用不同血小板计数方法评价其准确性，为实验室寻找快速、准确的EDTA-PTCP复检方法提供参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2020年5-8月成都市双流区第一人民医院18例EDTA-PTCP患者标本，其中男6例，女12例；年龄2～78岁，平均46岁。分别来自住院部9例(50.0%),门诊4例(22.2%),体检科5例(27.8%)。
1.2 纳入标准
(1)血小板计数≤70×109/L;(2)EDTA抗凝标本血小板计数随着时间的推移呈进行性减低；(3)外周血涂片血小板聚集。
1.3 仪器与试剂
(1)中国迈瑞(BC-6900)全自动血细胞分析仪及原装试剂；(2)日本Olmpus CX23显微镜；(3)EDTA-K2抗凝真空采血管及无抗凝剂的红色真空管、子弹头(康健医疗用品有限公司，中国江苏);(4)血小板计数溶血剂(凯诺威生物科技有限公司，中国成都);(5)瑞氏-吉姆萨染液(贝索公司，中国珠海)。
1.4 方法
1.4.1 手工法
准确采集所有患者末梢血20 μL,擦去管外余血，加至380 μL的血小板计数溶血剂中，充分混匀后室温静置，待完全溶血后再次混匀，充入2个计数池内，静置10～15 min, 待血小板下沉后显微镜下计数2个计数池内的血小板数量，取平均值。
1.4.2 仪器稀释法
抽取所有患者静脉血2 mL于无抗凝剂的真空管中，立刻吸取40 μL血液加入140 μL的迈瑞BC-6900全自动血细胞分析仪稀释液中，1～18例标本采用仪器稀释阻抗法测血小板法(PLT-I)上机检测，10～18例标本额外再采用仪器稀释光学法测血小板法(PLT-O)上机检测，记录血小板数量。因仪器稀释法在本实验室为采血稀释后0～5 min内上机检测，所以未进行时间分组。
1.4.3 PLT-I
采集所有患者EDTA-K2抗凝全血标本，充分混匀后分别于不同时间点(0～5 min、20 min、1 h、2 h)采用PLT-I检测血小板，记录4个时间点的血小板计数结果。
1.4.4 PLT-O
对1.4.3中采集的血液标本于1 h内采用PLT-O检测血小板，记录1 h内PLT-O的血小板计数结果。补充实验：10～18例标本补充了PLT-O的检测时间点，在0～5 min、20 min、1 h、2 h内采用PLT-O检测血小板，记录PLT-O检测的血小板计数结果。对每份标本进行涂片染色，并观察血小板聚集情况。
1.5 统计学处理
将数据录入WPS中进行整理，计算各种方法与手工法之间的偏差，以|y−x|x×100%计算，其中x为手工法计数血小板结果，y为其他方法计数血小板结果，当偏差≤12.5%时认为计数准确，并计算各种方法的准确率。采用spss 21.0统计软件进行数据分析处理。符合正态分布的计量资料采用重复测量方差进行分析。
2 结 果
2.1 18例标本不同检测方法及不同时间点血小板计数结果比较
随着时间的推移，EDTA-K2抗凝管PLT-I血小板检测数量呈进行性下降，但下降程度与时间存在个体差异，1 h内PLT-O检测血小板计数明显高于PLT-I,见图1。
图1 18例标本不同检测方法及不同时间点血小板 计数结果比较
2.2 不同检测方法血小板计数的准确率比较
准确率最高的方法是用EDTA-K2抗凝管全血0～5 min内采用PLT-I上机检测，准确率为77.8%;其次是仪器稀释法，准确率为72.0%;EDTA-K2抗凝全血1 h内PLT-O的准确率也较高，为61.0%。EDTA-K2抗凝全血1 h内的准确率PLT-O明显高于PLT-I。见表1。
表1 不同检测方法血小板计数的准确率比较(%,n=18)
2.3 补充实验中10～18例标本手工法与PLT-O血小板计数结果比较
补充实验中10～18例EDTA-K2抗凝标本PLT-O血小板计数随时间呈进行性下降，随着血小板聚集程度加重，PLT-O准确检测血小板的能力呈下降趋势，见图2。
图2 补充实验中10～18例标本手工法与PLT-O血小板 计数结果比较
2.4 外周血涂片镜检结果
通过外周血涂片镜检，所有EDTA-K2抗凝全血标本随时间推移均发生血小板聚集，且聚集程度随时间呈加重趋势，见图3。
2.5 PLT-O不同时间点准确率比较
补充实验中10～18例标本准确率最高的方法是用EDTA-K2抗凝管采全血后0～5 min内采用PLT-O上机检测，准确率为100.0%,其次为采血后20 min内上机检测及仪器稀释后0～5 min内采用PLT-O检测，准确率均为77.8%,见表2。
图3 EDTA-K2抗凝全血血小板聚集情况(瑞氏-吉姆萨染色,×1 000)
2.6 血小板形态
通过外周血涂片镜检发现第2例EDTA-PTCP住院患者血小板形态异常，随着病情恢复，血小板未再发生聚集，形态也恢复正常，其余17例患者血小板形态均正常，见图4。
图4 EDTA-PTCP患者血小板形态(瑞氏-吉姆萨染色×1 000)
表2 PLT-O不同时间点准确率比较(%,n=9)
3 讨 论
EDTA-PTCP似乎与年龄和性别无关，是否与特定的疾病和药物相关也无明确结论，存在于健康受试者和各种疾病患者中[4-6]。本研究中住院患者占50.0%,门诊患者占22.2%,体检者占27.8%,最小年龄为2岁，最大年龄为78岁，存在于各种疾病患者中。但部分EDTA-PTCP患者因血小板还未明显聚集已上机检测，导致无法及时发现，特别是门诊患者。成都市双流区第一人民医院要求30 min内审核报告，从图1可以看出，部分患者采血后30 min内已上机检测，其血小板计数大于100×109/L,这部分患者很难被发现，所以实际发生率可能更高。
目前，EDTA-PTCP的发生机制并不明确，主要有以下原因：(1)与自身抗体相关。自身抗体与血小板上的隐匿性抗原结合，导致血小板发生聚集，这种自身抗体可以是抗血小板抗体，也可以是抗心磷脂抗体。(2)与血小板上的隐匿性抗原相关。EDTA与Ca2+鳌合，导致血小板的结构发生改变，暴露出隐匿性抗原，抗原与抗血小板抗体结合，导致血小板聚集。(3)与血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa相关。GPⅡb/Ⅲa之间存在神秘表位，GPⅡb/Ⅲa需要Ca2+保持其二聚体结构，EDTA与Ca2+鳌合导致其结构发生变化，从而导致表位暴露在GPⅡb上，与抗血小板抗体结合发生聚集。但 EDTA依赖性抗体并不特异，除EDTA-PTCP外，也观察到EDTA依赖性白细胞聚集[11]。尽管目前的研究从不同角度阐述了各自的理论，但尚不能全部解释其发生机制。从图4可以看出，第2例EDTA-PTCP患者血小板形态异常，随着病情的恢复，当血小板未再发生聚集时血小板形态恢复正常，但无法明确是否与用药或者其他治疗相关。
针对EDTA-PTCP目前提出了诸多解决方法，主要分为两类。第一类是不需要二次采血的方法，主要有加入阿米卡星及振荡法等，加入阿米卡星能较好地解聚血小板，但等待解聚的时间较长，且灵敏度和特异度存在个体差异[7-10];抽血后1 h内加入6.5 mg/mL阿米卡星能有效解聚血小板，但文献[11-12]的标本仅有2例，是否存在不能解聚的情况还需进一步研究；振荡法比较简便快速，但不能解聚血小板的概率高，且振荡后破碎红细胞也会对血小板的测定造成干扰[13]。第二类是需要二次采血的方法，主要有手工法、仪器稀释法、抗凝剂替代法等，目前手工法仍是血小板计数的金标法，缺点是操作复杂、耗时长；仪器稀释法准确，但因无抗凝剂的参与，采血稀释过程中容易发生血液凝固导致血小板减低[10];抗凝剂替代法是目前最常用的方法，但多种抗凝剂依赖的患者不能采用此法。根据近来报道，迈瑞血细胞分析仪网织通道检测血小板效果较理想，迈瑞BC-6800和BC-6900全自动血细胞分析仪PLT-O具有血小板解聚功能[14],血小板聚集标本与反应溶液(解离试剂)在42 ℃的恒温条件下混合，然后在1 400 r/min的高速涡旋中进行搅拌，在剧烈振荡中对血小板聚集的物理结构进行机械破坏，并通过检测系统逐一检测。在这种情况下，血小板聚集迅速有效地解离，血小板使用光学方法被准确计数，通过此方法能较好地解决EDTA-PTCP,但目前的研究并未对PLT-O进行时间分组[15-16]。
本研究在前阶段实验中发现，即使采用PLT-O检测血小板，其计数仍会随着时间呈下降趋势，所以进行了补充实验，在10～18例标本中对PLT-O进行了时间分组，最终发现PLT-O优于PLT-I,而PLT-O中，采血后0～5 min内采用PLT-O上机检测的准确率为100.0%,故针对接受二次采血的非急重症患者，推荐使用此法。未加抗凝剂的仪器稀释后PLT-O虽然准确率为78.0%,10～18例标本中有2例偏差大于12.5%,但均为PLT-O大于手工法，考虑这其中存在随机误差，故对于静脉穿刺较难的婴幼儿和重症患者，采集末梢血仪器稀释后采用PLT-O为一种较好的方法。PLT-O随着标本放置时间延长，准确率呈下降趋势，这似乎与血小板聚集的严重程度相关，当血小板聚集特别严重时PLT-O准确率较低。18例标本1 h内PLT-O准确率为61.0%,但全部标本血小板计数均大于70×109/L,2020年中华医学会内科学会发布的《中国成人血小板减少症诊疗专家共识》指出，腰椎穿刺需要PLT≥40×109/L,肝脏活检需要PLT≥50×109/L,肾活检需要PLT≥100×109/L,牙科手术需要PLT≥(30～50)×109/L,一般大手术需要PLT≥50×109/L。故对于急需手术的患者，采血后1 h内采用PLT-O上机检测血小板仍为较好的一种方法，既为手术争取了时间，也不易导致误诊。
本研究通过镜检发现，部分患者即使采血后立即上机检测同样发生了血小板聚集，而采血后0～5 min内PLT-O准确率为100.0%,PLT-I为77.8%,PLT-O在一定程度上解决了这一问题，但因为病例有限，是否存在采用此法不能解决的患者还有待进一步收集数据验证。 本研究对迈瑞-6900全自动血细胞分析仪PLT-O进行时间分组实验，因EDTA-PTCP个体差异较大，用均值和标准差来对比血小板计数不能准确反映出方法的准确性，故本研究最终采用准确率来评估方法的准确性。但本研究最准确的方法仍不能避免二次采血，如何能快速、准确又不需要二次采血的解决这一问题还需继续研究。
综上所述，对于EDTA-PTCP患者，最准确的检测血小板计数的方法为采血后0～5 min内采用PLT-O上机检测，可有效缩短检测时间及减少误诊的方法为1 h内采用PLT-O上机检测。所以本科室针对EDTA-PTCP患者制订了以下复检方案：针对不是急查血小板计数的EDTA-PTCP患者，采血后0～5 min内采用PLT-O上机检测；对于静脉穿刺较难的婴幼儿和重症患者，采集末梢血仪器稀释后采用PLT-O上机检测；对于急查血小板计数的患者，采血后1 h内采用PLT-O上机检测。
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