摘 要：目的 探讨甲状腺滤泡细胞的自噬活性参与桥本甲状腺炎(HT)的发病机制的动物实验。方法 将30只NOD. H-2h4小鼠按照随机数字表法分为对照组和HT组,各15只。通过组织病理学观察小鼠中甲状腺炎的发生情况。通过实时聚合酶链式反应(RT-PCR)分析2组小鼠中促炎因子白细胞介素(IL)-23、IL-1β和干扰素-γ(IFN-γ)的mRNA表达。通过蛋白质印迹法分析小鼠LC3-II和Beclin及凋亡相关因子的蛋白表达。并通过免疫荧光法和流式细胞仪检测小鼠中活性氧(ROS)的积累。通过免疫组化分析AKT/mTOR/核因子κB(NF-κB)信号通路蛋白的表达。结果 HT组小鼠甲状腺组织中单核细胞的浸润程度为(1.75±0.25)分,高于对照组[(0.67±0.12)分],差异有统计学意义(P <0.05)。HT组小鼠甲状腺组织中IL-23、IL-1β和IFN-γ的mRNA表达水平分别为2.37±0.42、3.04±0.71、2.85±0.35,均高于对照组(1.26±0.14、1.15±0.16、1.09±0.12),差异均有统计学意义(P <0.05)。HT组小鼠甲状腺组织中LC3-Ⅱ和Beclin的蛋白表达水平分别为1.25±0.18、1.17±0.15,均低于对照组(2.07±0.34、2.59±0.46),差异均有统计学意义(P <0.05)。HT组小鼠甲状腺组织中Caspase-3、Caspase-9、Bax的蛋白表达水平分别为2.16±0.34、2.74±0.46、2.51±0.38,均高于对照组(1.18±0.15、1.32±0.17、1.08±0.09),Bcl-2蛋白表达水平(1.07±0.12)低于对照组(2.14±0.32),差异均有统计学意义(P <0.05)。HT组小鼠甲状腺滤泡细胞中阳性细胞占比、免疫荧光强度值分别为(62.79±10.47)%、43.18±7.26,均高于对照组[(12.56±3.15)%、16.72±3.58],差异均有统计学意义(P <0.05)。HT组小鼠甲状腺组织中AKT、mTOR和NF-κB的蛋白表达水平分别为2.34±0.41、2.15±0.38、2.09±0.21,均高于对照组(1.15±0.10、1.23±0.14、1.08±0.12),差异均有统计学意义(P <0.05)。结论在HT发病机制中,炎症细胞因子IL-23、IL-1β和IFN-γ通过AKT/mTOR/NF-κB信号通路诱导甲状腺滤泡细胞自噬激活,这会导致甲状腺滤泡细胞中的ROS积累和HT病理恶化。
关键词:小鼠;桥本甲状腺炎;甲状腺滤泡细胞;自噬;活性氧;炎症;
Autophagy activity of thyroid follicular cells is involved in animal experiments on the
pathogenesis of hashimoto's thyroiditis
MA Ding MA Chang-jun LU Fu-kun
Department of Endocrinology Bazhong Central Hospital
Abstract：Objective To investigate the autophagy activity of thyroid follicular cells involved in the pathogenesis of hashimoto's thyroiditis( HT) in animal experiments. Methods Thirty NOD. H-2 h4 mice were divided into control group and HT group according the random number table method,15 mice in each group. The occurrence of thyroiditis in mice was observed by histopathology. The mRNA expression of pro-inflammatory factors IL-23,IL-1β and interferon-gamma( IFN-γ) in the two groups of mice was analyzed by real-time polymerase chain reaction.The protein expression of mouse LC3-II,Beclin and apoptosis-related factors was analyzed by Western blotting. The accumulation of ROS in mice was detected by immunofluorescence and flow cytometry. Analyze the expression of AKT/m TOR/NF-κB signaling pathway proteins by immunohistochemistry. Results The degree of infiltration of monocytes in the thyroid tissue of mice in the HT group was( 1. 75 ± 0. 25) points,which was higher than that in the control group [( 0. 67 ± 0. 12) points],and the difference was statistically significant( P < 0. 05). The mRNA expression levels of IL-23,IL-1β and IFN-γ in the thyroid tissue of mice in the HT group were 2. 37 ± 0. 42,3. 04 ± 0. 71,2. 85 ± 0. 35,which were higher than those in the control group( 1. 26 ± 0. 14,1. 15 ± 0. 16,1. 09 ± 0. 12),the differences were statistically significant( P <0. 05). The protein expression levels of LC3-Ⅱ and Beclin in the thyroid tissue of mice in the HT group were 1. 25 ± 0. 18 and 1. 17 ± 0. 15,respectively,which were lower than those of the control group( 2. 07 ± 0. 34,2. 59 ± 0. 46),and the differences were statistically significant( P <0. 05). The protein expression levels of Caspase-3,Caspase-9 and Bax in the thyroid tissue of mice in the HT group were 2. 16 ± 0. 34,2. 74± 0. 46,2. 51 ± 0. 38,respectively,which were higher than those in the control group( 1. 18 ± 0. 15,1. 32 ± 0. 17,1. 08 ± 0. 09),the Bcl-2 protein expression level( 1. 07 ± 0. 12) was lower than that in the control group( 2. 14 ± 0. 32),the difference was statistically significant( P <0. 05). The percentage of positive cells in the thyroid follicular cells in the HT group and the immunofluorescence intensity values were( 62. 79 ±10. 47) % and 43. 18 ± 7. 26,respectively,which were higher than those in the control group [( 12. 56 ± 3. 15) %,16. 72 ± 3. 58],the difference were statistically significant( P < 0. 05). The protein expression levels of AKT,m TOR and NF-κB in the thyroid tissue of mice in the HT group were 2. 34 ± 0. 41,2. 15 ± 0. 38,2. 09 ± 0. 21,respectively,which were higher than those in the control group( 1. 15 ± 0. 10,1. 23 ±0. 14,1. 08 ± 0. 12),the differences were statistically significant( P < 0. 05). Conclusion In the pathogenesis of HT,the inflammatory cytokines IL-23,IL-1β and IFN-γ induce autophagy activation of thyroid follicular cells through the AKT/m TOR/NF-κB signaling pathway.This leads to accumulation of ROS in thyroid follicular cells and deterioration of HT pathology.
Keyword：Mice; Hashimoto's thyroiditis; Thyroid follicular cells; Autophagy; Reactive oxygen species; Inflammation;
桥本甲状腺炎(hashimoto's thyroiditis,HT)是最常见的器官特异性自身免疫性疾病，是由甲状腺免疫耐受能力下降引起的[1]。它的特点是淋巴细胞弥漫性浸润甲状腺，破坏甲状腺结构和产生自身抗体[2]。自噬是高度保守的生理过程，细胞内成分会经历溶酶体介导的自我消化和循环再利用，受损或老化的生物大分子和细胞器将从细胞质中移出[3]。在静止的细胞中，自噬发生在基础水平上，以消除内质网应激引起的缺陷细胞器，错误折叠的蛋白质和过量的蛋白质积聚。此外，自噬也是过量活性氧(reactive oxygen species,ROS)的重要清除机制，目的是防止细胞受损和死亡[4]。因此，自噬是正常细胞的生长、发育、功能和存活所必需的。在正常生理条件下，ROS对于甲状腺激素合成至关重要[5]。然而，异常高的氧化应激水平会导致对甲状腺滤泡细胞的损害，甲状腺的炎症，并最终促进HT的发展[6]。有证据表明，由于女性甲状腺中较高的氧化应激水平，女性甲状腺疾病的患病率较高[7]。HT与严重的神经炎症有关。胶质细胞，包括小胶质细胞和星形胶质细胞是中枢神经系统的免疫细胞，是神经炎症的主要细胞调节因子[8]。正常情况下，神经胶质细胞处于静止状态，但是在病理条件下，它们变得过度活化并释放出大量的神经毒性物质，例如促炎性细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-6[9]。已经发现自噬缺陷通过调节疾病状况的许多关键方面而赋予了几种自身免疫和炎性疾病的敏感性[10]。但是，HT的自噬机制仍然难以捉摸。在HT发病机制中，尚未完全了解诱导过量ROS积累的机制。本研究旨在探究甲状腺滤泡细胞的自噬活性参与HT的发病的动物实验。
1 材料与方法
1.1 实验动物
30只5周龄NOD.H-2h4小鼠购自四川大学(实验动物中心)[许可证号:SYXK(川) 2018-185]，体重约20 g，雌雄不限。在特定的无病原体条件下在大学动物实验室设施中繁殖和饲养小鼠。小鼠在标准实验室条件下(23±2)℃、光照12 h/黑暗12 h、湿度(55±5)%。5只小鼠为一组进行饲养，可随意获得自来水和啮齿动物食物。所有动物研究程序均符合实验动物的护理和使用指南。
1.2 试剂与仪器
完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant,CFA)、不完全的弗氏佐剂(incomplete Freund's adjuvant,IFA)、甲状腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)由美国Sigma-Aldrich公司提供;胶原酶Ⅳ由美国Sigma公司提供，货号C1889;TRI试剂由加利福尼亚州卡尔斯巴德市的Invitrogen公司提供;AMV由美国威斯康星州的Promega公司提供;全细胞提取试剂盒、聚乙烯基二氟乙烯膜(polyvinyl difluoroethylene film,PVDF)由美国Merck Millipore公司提供;二喹啉酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白浓缩试剂盒、2,7-二氯氢荧光素二乙酸盐(2,7-Dichlorohydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)由上海碧云天生物技术有限公司提供;Pierce ECL-plus底物由美国Thermo Fisher科学公司提供;lightcycler480仪器由德国Roche公司提供;抗生蛋白链菌素过氧化物脂结合的二抗由北京博奥森斯科贸有限公司提供;Alpha View软件由美国AIC公司提供;流式细胞仪由美国BD Biosciences公司提供，型号BD FACS Calibur;荧光显微镜由日本奥林巴斯公司提供。
1.3 实验分组与HT模型建立
将所有小鼠按照随机数字表法分为对照组和HT组，每组各15只。所有小鼠适应1周后，HT组小鼠接受25μg在CFA中乳化的猪Tg乳化，皮下注射到尾巴底部，14 d后用IFA加强注射等剂量的Tg。对照组:小鼠用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution,PBS)代替Tg处理。尾静脉取血，酶联免疫吸附试验检测其血清TPOAb水平，TPOAb水平>60 IU/m L为模型建立成功。
1.4 方法
1.4.1 样品收集
建模后的最后1 d，将小鼠深度麻醉并在早晨(上午9︰00～11︰30)脱臼处死。立即收集血液、甲状腺。将血液样品离心以测量血清学参数，收集甲状腺用于组织病理学。
1.4.2 甲状腺滤泡细胞收集与培养
获取小鼠甲状腺组织。将新鲜的甲状腺组织用剪刀切成约1 mm3的小块，并与胶原酶IV(1.25 mg/m L)在Hank's溶液中于37℃孵育4 h。通过70μm的尼龙细胞过滤器过滤细胞悬浮液。将滤液以1 000×g离心5 min。将细胞重悬于含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI-1640中。然后，将甲状腺细胞铺在6孔板中(每孔1×106细胞)。24 h后，除去不含黏附细胞的上清液。将甲状腺滤泡细胞在RPMI-1640、10%FBS和Pen/Strep中于5%CO2中于37℃培养。
1.4.3 苏木精和曙红染色
对于组织病理学，固定新鲜的甲状腺组织并进行苏木精和曙红处理。从每只动物的5个不连续冠状切片中检查甲状腺的组织病理学。甲状腺炎分类标准是根据甲状腺浸润的百分比确定的:0为无浸润;1分为1～2个卵泡周围的炎性细胞间质积聚;2分为1～2个炎症细胞灶达到卵泡大小;3分为10%～40%炎症细胞浸润;4分为大于40%的炎症细胞浸润。2名研究者对组织学评分进行评估并取平均值。
1.4.4 RNA纯化和实时聚合酶链式反应(real-timepolymerase chain reaction,RT-PCR)
根据制造商的指导原则，使用TRI试剂从甲状腺组织中提取总RNA，并用无RNase的DNase处理，用AMV进行逆转录。PCR在lightcycler 480仪器上进行，初始保持步骤(95℃，5min)，在95℃下15 s，在60℃下15 s的50个循环，以及在72℃下30 s。使用2-ΔΔCt方法分析甲状腺组织IL-23、IL-1β和干扰素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)相对表达水平。
1.4.5 蛋白质印迹分析
使用全细胞提取试剂盒从甲状腺组织中提取总蛋白。使用BCA蛋白浓缩试剂盒确定总蛋白浓度。首先，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶对5 mg蛋白质进行电泳，通过电泳将其转移到PVDF上。在5%牛血清白蛋白中封闭1 h后，将膜与抗蛋白质或β-肌动蛋白的抗体(标准对照)孵育，与HRP偶联的二抗孵育。使用Pierce ECL-plus底物检测信号，并使用Fluor Chem FC3摄像头系统进行扫描。使用Alpha View软件分析图像，并以图形方式显示定量分析的结果。
1.4.6 ROS水平检测
使用荧光探针DCFH-DA(购自美国MCE公司)监测小鼠甲状腺组织滤泡细胞中ROS水平，这是一种过氧化氢的特异性探针。收集组织用胰蛋白酶处理后，洗涤，并在无FBS的RPMI-1640中重悬3遍。使用流式细胞仪立即检测和分析1×105个细胞的DCF荧光，其激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。通过流式细胞术分析甲状腺滤泡细胞内ROS水平，采用阳性细胞的百分比(%阳性细胞)和平均荧光强度表示。另外使用荧光显微镜评估了从Nthy-ori 3-1细胞产生的ROS的DCF荧光。
1.4.7 免疫组织化学分析
将甲状腺组织固定在4%中和的甲醛溶液中，包埋在石蜡中，切成4 mm的切片，安装在载玻片上。解离和补液后，通过将样品在10mmol/L柠檬酸盐缓冲液(p H 6.0)中煮沸10 min，用PBS洗涤载玻片来进行抗原修复。将切片用PBS中的2%牛血清白蛋白封闭30 min，在4℃下与兔抗人AKT、m TOR、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)抗体孵育过夜。用PBS洗涤3次后，将切片用相应的抗生蛋白链菌素过氧化物脂结合的二抗处理。将组织切片用3,30-二氨基联苯胺和苏木精复染色，并在光学显微镜下观察。图形显示了Image-Pro plus 6.0软件对所有样品进行的定量分析结果。
1.5 统计学处理
所有统计分析均使用Graph Pad Prism 5.0进行。计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HT组织病理学检测
通过组织病理学苏木和曙红染色观察小鼠中HT的发生，HT小鼠的甲状腺炎浸润严重程度(1.75±0.25)分高于对照组(0.67±0.12)分，差异有统计学意义(t=15.084,P<0.001)。组织学检查显示，对照组小鼠的甲状腺滤泡完整，分布均匀，在甲状腺组织中几乎未见单核细胞浸润。相反，HT小鼠表现出甲状腺肿大，甲状腺滤泡无序和破坏，并且在甲状腺组织中或多或少地发现了单核细胞浸润。
2.2 IL-23、IL-1β和IFN-γmRNA表达
HT组小鼠甲状腺组织中促炎因子IL-23、IL-1β和IFN-γmRNA表达均较对照组显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 2组小鼠IL-23、IL-1β和IFN-γmRNA表达水平比较
2.3 LC3-Ⅱ和Beclin蛋白表达
HT组小鼠甲状腺组织LC3-Ⅱ和Beclin蛋白表达均较对照组显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。
表2 2组小鼠LC3-Ⅱ和Beclin蛋白表达水平比较
2.4 凋亡蛋白表达
HT组小鼠甲状腺组织Caspase-3、Caspase-9、Bax的蛋白表达水平均较对照组显著升高，Bcl-2蛋白表达水平较对照组显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。
表3 2组小鼠凋亡蛋白表达水平比较
2.5 ROS水平
HT组小鼠甲状腺滤泡细胞中ROS阳性细胞占比、免疫荧光强度值均较对照组显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。
表4 2组小鼠ROS水平检测结果比较
2.6 AKT/m TOR/NF-κB信号通路的蛋白
HT组小鼠甲状腺组织中AKT/m TOR/NF-κB信号通路蛋白的表达水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。
表5 2组小鼠AKT/m TOR/NF-κB信号通路的蛋白表达水平比较
3 讨论
HT是一种常见的自身免疫性甲状腺疾病，影响了大约5%的普通人群，尤其是女性，其特征是甲状腺内单核细胞浸润以及血清自身抗体的升高，这是甲状腺功能减退的主要原因[11,12]。但是，大多数患者(约79.3%)在诊断时表现出正常的甲状腺功能，并且可能多年甲状腺功能正常[13]。
自噬是在许多情况下导致程序性细胞死亡的关键途径[14]。这是细胞分裂自身成分的基本和稳态过程，从而避免了坏死引起的有害作用。一些研究人员揭示了自噬途径及其相关蛋白在免疫和炎症中的关键作用[15]。自噬过程平衡了免疫和炎症的有益和有害影响，并可以预防传染病，自身免疫和炎性疾病的发展[16]。本研究结果显示，HT小鼠的甲状腺滤泡细胞中检测到自噬相关蛋白(即LC3-Ⅱ和Beclin)活性降低，细胞凋亡水平升高。
凋亡在HT中起重要作用。在甲状腺组织的凋亡过程中，Bcl-2家族和促凋亡蛋白BH3相互作用域死亡激动剂(Bid)可以激活Caspase-8分子并启动内源性途径来激活凋亡以释放细胞色素C[17]。在d ATP存在下，细胞质与细胞凋亡相关因子1结合，并促进Caspase-9的结合，从而形成凋亡小体。激活的Caspase-9可以激活其他Caspase，例如Caspase-3并诱导凋亡[18]。内在途径(线粒体)的激活还可以直接破坏细胞的基本结构，例如DNA，并导致代谢错位或破坏细胞周期[19]。甲状腺组织的稳态对于甲状腺甲状腺细胞非常重要。本研究结果显示，HT小鼠的甲状腺滤泡细胞凋亡率增加，Caspase-3和Caspase-9表达升高;凋亡因子Bax的表达升高，抗凋亡因子Bcl-2的表达降低，Bcl-2/Bax的比例降低。
ROS是由活生物体的所有细胞产生的，能够在氧化还原相关的不同细胞功能调节中起作用，包括对应激物的反应，血管生成和细胞增殖。甲状腺激素生成过程中，在甲状腺中需要适量的ROS。但是，过量的ROS会导致甲状腺滤泡细胞的病理损伤和自身免疫性甲状腺疾病(例如HT和GD)的发展[20]。ROS的产生和氧化应激与各种生长因子和细胞因子的产生和激活相互关联。近年来的许多工作表明，与简单的开/关信号相比，ROS的产生与自噬的发生更为紧密和协调[21]。过量的ROS可通过细胞成分的氧化而引起细胞损伤，从而导致细胞损伤无法修复并诱导细胞凋亡。在正常生理条件下，基础自噬负责清除非功能性线粒体和蛋白质积累和其他细胞器的细胞质。细胞自噬缺陷导致去极化线粒体和蛋白质的积累，从而诱导炎性体激活剂(如ROS或线粒体DNA)的释放。自噬抑制作用允许促炎性细胞因子的加工和分泌，该过程可能取决于ROS的积累。ROS可以通过刺激ATG4的蛋白水解活性和其他机制来诱导自噬。此外，自噬已被证明可以通过减少线粒体ROS的产生来保护细胞免受DNA损伤[22]。研究表明，自噬可通过降低软骨细胞中的ROS水平来保护软骨细胞免于凋亡[23]。值得注意的是，自噬的抑制可能导致生物体能量不足，并促进触发凋亡的氧化反应。本研究初步研究表明，在在HT小鼠的甲状腺滤泡细胞中可以观察到ROS积累增加，说明ROS参与HT的炎症过程。
有报道表明，AKT/m TOR信号通路在自噬体形成的调控中起重要作用[24]。本研究证明，在HT发病机制中，炎性细胞因子IL-23、IL-1β和IFN-γ通过AKT/m TOR/NF-κB信号通路诱导甲状腺滤泡细胞自噬激活，这会导致甲状腺滤泡细胞中的ROS积累和HT病理恶化。因此，靶向炎症因子、自噬激活或m TOR可提供潜在的治疗策略，以防止甲状腺细胞受到细胞氧化损伤。
4 结论
总而言之，HT抑制了甲状腺滤泡细胞自噬活性和ROS在甲状腺滤泡细胞中的积累取决于AKT/m TOR/NF-κB信号通路的激活，靶向炎症因子、自噬激活或m TOR可提供潜在的治疗策略，以防止甲状腺细胞受到细胞氧化损伤。
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